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Fragestellung: Die Vaskularisation spielt eine entscheidende Rolle bei der künstlichen Gewebezüchtung des Knochens. Die gefäßbildenden Zellen (Endothelzellen, ECs) stellen somit einen wichtigen Bestandteil des Knochengewebes dar, wobei der direkte Zell-zu-Zell Kontakt zwischen diesen Zellen und den knochenbildenden Zellen (Osteoblasten, hOBs) eine komplexe Interaktionskaskade bewirkt, die für die Funktion beider Zelltypen wichtig ist. In diesem Zusammenhang ist u.a. bekannt, dass die Differenzierung der hOBs angeregt wird, was anhand der Zunahme der mRNA Stabilität der osteoblastären Differenzierungsmarker alkalischen Phosphatase (ALP) gemessen werden kann. Wir haben die hierfür verantwortlichen RNA-bindenden Proteine untersucht.

Material und Methoden: Um die Interaktion der RNA-bindenden Proteine mit der ALP mRNA zu untersuchen, haben wir die 3’-untranslatierte Region der mRNA der Osteoblasten amplifiziert und biotinyilisiert. Diese wurde dann mit Zellysaten der hOBs inkubiert und anschließend mit Streptavidin-konjugierten magnetischen Partikeln isoliert. Die Partikel-RNA-Protein- Komplexe wurden dann in SDS lysiert und elektophoretisch aufgetrennt. Differenziell exprimierte Banden wurden ausgeschnitten und mittels nanoflow-HPLC-MS Massenspektometrie untersucht. Die Bestätigungsversuche wurden mittels Western Blot durchgeführt. Funktionelle Unterdrückung des Vimentins wurde durch Inkubation mit 1% Iminodipropionitrile (IDPN) sowie durch Transfektion mit Anti-Vimentin siRNA erreicht. Anschließend erfolgte die mRNA Quantifizierung mittels TaqMan RT-qPCR und ALP Aktivitätsmessung mittels CSPD Lumineszenzassay.

Ergebnisse: Der Biotin-pulldown Assay und die anschließende massenspektrometrische Untersuchung haben Vimentin als einen potenziellen Bindungspartner der ALP mRNA identifiziert. Dieser Befund wurde mittels Western Blotting unterstützt. Inhibierung der Intermediärfilamente mittels IDPN bewirkte eine signifikante Reduktion der kokultivierungsbedingten Zunahme der ALP mRNA und ALP Proteinaktivität. Spezifische Inhibition des Vimentins durch siRNA bewirkte eine Reduktion der ALP Expression und der ALP Proteinaktivität in den mono- und kokultivierten hOBs. (Abbildung 1 [Abb. 1])

Schlussfolgerung: Unsere Arbeit zeigt erstmalig, dass die mRNA der ALP an die Intermediärfilamente des Zytoskelets bindet, und dadurch stabilisiert wird. Diese Interaktion kann potenzielle Auswirkung auf den intrazellulären Transport der mRNA haben und somit auch auf die Funktion der osteoblastären ALP.