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Besiedelung und dynamische Ko-Kultivierung verschiedener Kollagen-Matrices mit humanen mesenchymalen Stammzellen und humanen mikrovaskulären Endothelzellen im Bioreaktor
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Authors
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J. Weyhmüller
- Universitätsklinikum Würzburg, Lehrstuhl für Tissue Engineering und Reg. Medizin, Würzburg, Germany
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A. Heymer
- Universitätsklinikum Würzburg, Lehrstuhl für Tissue Engineering und Reg. Medizin, Würzburg, Germany
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M. Rudert
- Universität Würzburg, Orthop. Zentrum für Muskuloskelettale Forschung, König-Ludwig-Haus, Würzburg, Germany
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H. Walles
- Universitätsklinikum Würzburg, Lehrstuhl für Tissue Engineering und Reg. Medizin, Würzburg, Germany
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A. Steinert
- Orthopädische Klinik, König-Ludwig-Haus, Orthopädisches Zentrum für Muskuloskelettale Forschung, Lehrstuhl für Orthopädie der Universität Würzburg, Würzburg, Germany
| Published: | October 18, 2011 |
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Fragestellung: Implantate, wie auch Tissue Engineering Konstrukte zum Meniskusersatz, sind bisher wegen ihrer fehlenden Integrationsfähigkeit ohne Erfolg geblieben. Ein zellbasiertes Meniskuskonstrukt, welches mit einer neuartigen Biomatrix vaskularisiert wird, soll neue Behandlungsperspektiven eröffnen. Hierzu wurden in vitro dreidimensionale Konstrukte mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSZ) besiedelt, um eine geeignete Matrix mit einer homogenen Zellverteilung zu evaluieren. Weiter erfolgte der Aufbau von Ko-Kultursystemen der hMSZ mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (hmvEZ) in der ausgewählten Matrix in einem Bioreaktor.
Methodik: Die Besiedelung von insgesamt 5 verschiedenen Matrices erfolgte mit aus Knochenmark isolierten hMSZ und verschiedenen Zellkonzentrationen. Es wurde ein 3D Kollagen Scaffold (BD, Heidelberg), die Bio-Gide Membran (Geistlich, Baden-Baden), ein Kollagen BioMesh (Bard, Covington), eine mittels Elektro-Spinning hergestellte Kollagen-Typ-I-Matrix (Kol-I-ES) und ein Kollagen-Typ-I-Hydrogel (Kol-I-HG, Fh-IGB, Stuttgart) verwendet. Histologische Färbungen (HE und Lebend-Tot-Färbung) ermöglichten die Untersuchung der besiedelten Matrices auf das Zellwachstumsverhalten und die Vitalität. Die Durchführung immunhistologischer Färbungen diente zur Charakterisierung der Zellen im Konstrukt. Die Marker CD31 und vWF wurden zur Charakterisierung der hmvEZ verwendet. Kollagen I diente zum Nachweis der extrazellulären Matrix der hMSZ.
Weiterhin erfolgte die Ko-Kultivierung der mit hMSZ besiedelten Matrix und hmvEZ in einem Bioreaktor, wobei diese mit einem gering pulsierenden Fluss (80 zu 120 mmHg, Frequenz 1 Hz) dynamisch kultiviert wurden.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Bei Einbringung von 0,5 Millionen Zellen in 1 ml Kol-I-HG sowie auf 50 mm2 Kol-I-ES konnte eine homogene Zellverteilung beobachtet werden. Durch Lebend-Tot-Färbung wurde die Vitalität der hMSZ im Gel sowie in der Kol-I-ES nachgewiesen. Immunhistologisch konnte die Synthese von Kollagen I detektiert werden.
Die HE Färbung aller anderen Matrices belegte, dass die Zellen am Rand einen Monolayer bildeten, im Inneren der Matrix jedoch nicht zu detektieren waren. Daher wurden diese Matrices für weitere Versuche nicht verwendet.
Erste Vorversuche unter dynamischen Kultivierungsbedingungen haben gezeigt, dass beide Zelltypen im Konstrukt überleben und die hmvEZ einen Monolayer auf der Matrix bildeten. Immunhistologische Färbungen mit den typischen Endothelzell-Markern CD31 und vWF waren positiv.
HMSZ konnten in vitro erfolgreich im Kol-I-HG sowie auf Kol-I-ES sowohl unter statischen als auch dynamischen Bedingungen kultiviert werden. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob die Ko-Kultivierung von hMSZ mit hmvEZ und/oder der Einsatz von Wachstumsfaktoren einen Einfluss auf die Differenzierung der Zellen haben und ob das Konstrukt über einen längeren Zeitraum stabil bleibt.
