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Texte intégral
Doctoral thesis

Interaction of Per and Cry genes in the mammalian circadian clock

    08.11.2002

166 p

Thèse de doctorat: Université de Fribourg, 2002

English German To cope with the daily changes in their environment, in organisms, from cyanobacteria to humans, endogenous clocks have evolved that anticipate these changes and synchronize physiology and behavior accordingly. In mammals, the central circadian pacemaker is located in the suprachiasmatic nuclei (SCN) of the hypothalamus. From there subordinated cellular clocks in the peripheral organs are controlled to create the overall rhythm of the organism. Circadian rhythms persist in the absence of external time information with near 24h periods, hence the term “circadian” from the Latin circa dies meaning “about one day” (Halberg, 1952). Time signals from the environment (so called Zeitgeber) like light, temperature variations, or food intake can phase shift the endogenous oscillator to synchronize the organism to geophysical time. On the molecular level circadian clocks are built of cellular oscillators. Pacemaker genes like Clock, Bmal1, mPer1 and 2, mCry1 and 2 or Casein kinase 1ε are organized in a system of transcriptional/ translational feedback loops creating precise, stabilized 24h rhythms. In this study we worked with two different model systems. We used transgenic mice (Mus musculus) with a targeted disruption of specific genes (mPer1 and 2, mCry1 and 2) or a combination of these genes to elucidate their function in the circadian clockwork. In a second project we examined the clock of the blind mole rat superspecies (Spalax ehrenbergi). Its isolated subterranean habitat, its adaptive visual and neuronal reorganization, and its polymorphic activity profile makes Spalax an extremely interesting model organism to study the evolution of the clock under special environmental conditions. In mice we show that an additional deletion of the mCry2 gene in mPer2 mutants or a deletion of mCry1 in mPer1 mutants restores wild-type rhythmicity on the behavioral and the molecular level. This indicates that mCry2 acts as a non-allelic suppressor of mPer2 and mCry1 of mPer1 in the circadian oscillator. Young mPer1/ mCry2 double mutants display a very long free-running period and lose rhythmicity with progressing age while mPer2/ mCry1 mutants have no functional clock at all. This is accompanied by abnormal clock gene and protein regulation in the SCN and the eye. Based on these findings we developed a model for the interaction of the mPer and mCry genes in the cellular oscillator providing new insights on how the clock is stabilized and integrates external time information at the molecular level. A multiunit complex of mPER and mCRY proteins forms the negative limb of the autoregulatory feedback loop controlling the periodic activation of clock genes. Specific preferences for homo and heteromeric protein interactions between all mPER and mCRY proteins form a self-stabilizing oscillator at the transcriptional level. By deleting one or more of its components, the stability of the pacemaker is disturbed and the interaction preferences are altered. If this disturbance exceeds the compensation limits of the clock, the oscillation dampens and the animals become arrhythmic. In Spalax we elucidated the molecular organization of the cellular clockwork by studying gene expression. We show that Spalax has a functional circadian clock on the molecular level with pacemaker genes like Clock, Bmal1, Per1, 2 and 3 as well as two Crys. The clockwork of Spalax is highly similar to other rodents although some properties show specific adaptation to its subterranean habitat. Our findings suggest that the hypertrophic Harderian gland surrounding the rudimentary and visually blind eye of these animals plays a functional role in the circadian system probably stabilizing the SCN pacemaker during continuous absence of outside time information. Spalax can shift from a nocturnal to a diurnal activity pattern. We found that in nocturnal animals the central oscillator is uncoupled from the light driven input pathway indicating a specific control of clock entrainment pathways in both activity types. Taken together this work provides new insights on redundant as well as distinct functions of the Per and Cry genes in the molecular mechanism of the circadian clockwork. It demonstrates the conservation of the system of autoregulatory feedback loops to stabilize circadian rhythmicity as well as highlights the evolutional adaptation of external clock regulation to the ecotope of the organism. Um sich optimal an die periodischen Veränderungen ihres Lebensraums im Verlauf des Tages anzupassen, besitzen die Lebewesen, von den Purpurbakterien bis zum Menschen, eine innere Uhr, die diese Zyklen antizipiert und Stoffwechsel und Verhalten dazu synchronisiert. In Säugetieren sitzt der zentrale innere Schrittmacher im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) des Hypothalamus‘. Von dort werden untergeordnete Uhren in den Organen des Körpers kontrolliert, die dann den Gesamtrhythmus des Organismus erzeugen. Auch wenn der Körper keine Zeitinformationen mehr von außen erhält, bleiben die zirkadianen Rhythmen stabil mit Periodenlängen von ungefähr 24h, daher der Ausdruck „zirkadian“ von dem lateinischen circa dies, was soviel heißt wie „ungefähr ein Tag“. Hinweise über die Tageszeit, so genannte Zeitgeber, wie Licht, Temperaturveränderungen oder Nahrungsaufnahme können die Phase des endogenen Oszillators verschieben, um so den Organismus ständig mit der geophysikalischen Zeit zu synchronisieren. Auf molekularer Ebene besteht die zirkadiane Uhr aus einzelnen zellulären Oszillatoren. Uhrengene wie Clock, Bmal1, mPer1 und 2, mCry1 und 2 sowie Caseinkinase 1ε sind in einem System von Transkriptions-/ Translations-Rückkopplungsschleifen organisiert, das einen präzisen und stabilen 24h-Rhythmus generiert. In der vorliegenden Arbeit haben wir mit zwei unterschiedlichen Modellsystemen gearbeitet. Wir benutzten transgene Mäuse (Mus musculus), in deren Erbgut einzelne oder eine Kombination bestimmter Gene (mPer1 und 2 sowie mCry1 und 2) gezielt zerstört wurden, um deren Funktion im zirkadianen Uhrwerk zu bestimmen. In einem zweiten Projekt untersuchten wir die innere Uhr der Blindmaus (Spalax ehrenbergi). Sein isoliertes unterirdisches Habitat, eine adaptive visuelle und neuronale Reorganisation sowie sein polyphasisches Aktivitätsprofil machen Spalax zu einem äußerst interessanten Modellorganismus zum Studium der Entwicklung innerer Uhren unter besonderen Umweltbedingungen. An Mäusen zeigen wir, dass eine zusätzliche Deletion des mCry2-Gens in mPer2-mutanten Tieren sowie eine Deletion von mCry1 in mPer1-Mutanten die wildtyp-artige Rhythmizität auf Verhaltens- sowie auf molekularer Ebene wiederherstellt. Dies deutet darauf hin, dass mCry2 als nicht-allelischer Suppressor von mPer2 und mCry1 als nicht-allelischer Suppressor von mPer1 im zirkadianen Oszillator fungiert. Junge mPer1/ mCry2-Doppelmutanten zeigen eine extrem lange Periodenlänge unter Freilaufbedingungen. Sie verlieren ihre Rhythmizität jedoch mit fortschreitendem Alter. mPer2/ mCry1-Mutanten dagegen besitzen von Geburt an keine funktionierende innere Uhr. Dies geht einher mit veränderter Uhrengen- und – proteinregulation im SCN sowie im Auge. Auf der Grundlage diese Beobachtungen haben wir ein Modell zur Interaktion der mPer- und mCry-Gene im zellulären Oszillator entwickelt. Ein multimerer Komplex aus mPER- und mCRY-Proteinen bildet den negativen Arm einer autoregulatorischen Rückkopplungsschleife, welche die periodische Aktivierung der Uhrengene kontrolliert. Spezifische Präferenzen für homo- und heteromere Interaktionen zwischen allen mPER- und mCRY-Proteinen generieren einen selbststabilisierenden Oszillator auf transkriptioneller Ebene. Entfernt man eine oder mehrere der Komponenten aus diesem System, wird dessen Stabilität beeinträchtigt und die Interaktionspräferenzen werden verändert. Überschreitet diese Störung die Kompensationsmöglichkeiten der Uhr, wird die Oszillation gedämpft und die Tiere werden arrhythmisch. An Spalax untersuchten wir die molekulare Organisation des zellulären Uhrwerks anhand der Genexpression. Wir zeigen, dass Spalax eine funktionelle molekulare Uhr besitzt mit Uhrengenen wie Clock, Bmal1, Per1, 2 und 3 sowie zwei Crys. Diese ist dem anderer Nagetiere sehr ähnlich, zeigt aber eine gewisse Anpassung an sein unterirdisches Habitat. Unser Ergebnisse deuten darauf hin, dass die hypertrophe Hardersche Drüse, die das rudimentäre und visuell blinde Auge dieser Tiere umgibt, eine funktionelle Rolle im zirkadianen System übernommen hat und den Schrittmacher im SCN während andauernder Abwesenheit äußerer Zeitinformation stabilisiert. Spalax kann von einem tagaktiven zu einem nachtaktiven Verhaltensmuster wechseln. Wir konnten zeigen, dass in nokturnalen Tieren der zentrale Oszillator der Uhr vom Lichteinfluss entkoppelt ist, was auf eine spezifische Kontrolle der Signalwege zur zeitlichen Synchronisierung der Uhr hindeutet. Zusammengefasst gewährt diese Arbeit neue Einsichten in die redundanten sowie die spezifischen Funktionen der Per- und Cry-Gene im molekularen Mechanismus der zirkadianen Uhr. Sie betont die Konservierung des Systems autoregulatorischer Rückkopplungsschleifen zur Stabilisierung zirkadianer Rhythmik und zeigt ebenso die evolutionäre Adaption der externen Regulation der Uhr an die Lebensbedingungen des Organismus.
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Medicine
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