Role of HNO-dependent oxidation of cGMP-dependent protein kinase I alpha (PKGIα) for vasorelaxation

Abstract

Im Rahmen kardiovaskulärer Erkrankungen werden oftmals Stickstoffmonoxid (NO) basierte Medikamente verabreicht, um durch eine Relaxation der Koronargefäße die Sauerstoffversorgung der Herzmuskelzellen zu verbessern. So können pektanginöse Beschwerden der Patienten gelindert werden. Gleichzeitig führt allerdings die andauernde Verwendung dieser NO basierten Medikamente zur Toleranz und die Wirkung wird dadurch vermindert. Die Säure des reduzierten Stickstoffmonoxids, die als Nitroxyl (HNO) bezeichnet wird, weist ebenfalls vasorelaxierende sowie positiv inotrope Effekte auf, ohne dabei eine Toleranz zu induzieren. Gegenwärtig werden diese Effekte in klinischen Studien überprüft. Ungeklärt bleibt nach wie vor, wie die pro-oxidativ wirkenden HNO Donatoren ihren vorbeschriebenen vasorelaxierenden Effekt ausüben. Im Rahmen dieser Studie führten zwei HNO Donatoren mit unterschiedlichen kinetischen Eigenschaften in murinen Wildtyp (WT) Mesenterialarterien zu einer konzentrationsabhängigen Vasorelaxation. Die zugrunde liegende Hypothese dieser Arbeit hinterfragt, ob eine HNO-vermittelte oxidative posttranslationale Modifikation der cGMP-abhängigen Proteinkinase I alpha (PKGIα) die Aktivität dieser Kinase beeinflusst und somit als molekulare Grundlage der HNO vermittelten Vasorelaxation interpretiert werden kann. In vorangehenden Studien wurde bereits eine Interdisulfidbrücke zwischen dem jeweiligen Cystein 42 (C42) der benachbarten Aminosäureketten des PKGIa Homodimers beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass diese Interdisulfidbrücke zu einer cGMP-unabhängigen Aktivierung der Kinase und dadurch zur Vasorelaxation führt. Diese zeigte sich nun auch nach einer Behandlung der Zellen mit HNO Donatoren. Gleichzeitig stellte sich infolge der HNO Donatoren eine Intradisulfidbrücke zwischen C117 und C195 innerhalb der hochaffinen cGMP-Domäne dar. Zur weiteren Charakterisierung der Auswirkungen dieser neuartigen Intradisulfidbrücke wurden die Bindungseigenschaften von cGMP an rekombinanter PKGIα untersucht. HNO Donatoren reduzierten die cGMP Affinität zur Kinase. Unter Verwendung eines spezifischen Fluoreszenz Energie Transfer (FRET) Sensors mit einer übereinstimmenden Phosphorylierungsdomäne für AGC-Kinasen sollte nun die Auswirkung auf die Kinaseaktivität experimentell untersucht werden. HEK293T Zellen wurden mit dem FRET Sensor und WT-PKGIa oder oxidationsdefizienten PKGIa Mutanten transfiziert. In Zellen mit PKGIα-WT Expression resultierte die Applikation von HNO Donatoren in einer gesteigerten FRET-Aktivität gegenüber Zellen, die nur mit dem FRET Sensor transfiziert worden waren. Gleichzeitig zeigte sich in Zellen mit PKGIα-C42S eine verminderte FRET Aktivität gegenüber den PKGIα-WT Zellen. Die Zellen mit PKGIa-C117/195S zeigten eine vergleichbare FRET-Aktivität. Als weiterer Surrogatparameter zur Einschätzung der PKGIa-Aktivität in Abhängigkeit von HNO Donatoren wurden Zellen mit dem bereits etablierten Phosphorylierungssubstrat VASP (Phosphorylierungsstelle Serin 239) transfiziert. Auch hier zeigte die Analyse der Western-Immunoblots eine gesteigerte VASP-Phosphorylierung im PKGIα-WT Modell infolge der HNO Donatoren, im Vergleich zu Zellen, die nur mit einer Kontrolllösung behandelt worden waren. Gleichzeitig war die VASP-Phosphorylierung in Zellen mit der PKGIα-C42S Mutante vermindert. Eine mit dem WT vergleichbare VASP- Phosphorylierung wurde in Zellen mit der PKGIα-C117/195S Mutante gesehen. Anschließend wurde die Kinaseaktivtät zuletzt auch in in vitro Kinase Analysen unter Verwendung eines etablierten, rekombinant exprimierten Substratproteins von PKGIα und 32P-ATP bestimmt. Erneut konnte infolge der Behandlung mit HNO Donatoren eine gesteigerte Aktivität der PKGIα-WT Kinase beschrieben werden. Dieser Effekt war signifikant reduziert in Zellen mit den Intra- bzw. Interdisulfidbrücken Mutanten PKGIα-C42S und PKGIα-C117/195S. Die oxidationsdefiziente PKGIα-C42/117/195S Mutante zeigte keinerlei Kinaseaktivität infolge der HNO Donatoren. Abschließend konnte im in vivo Modell mittels intravitaler Mikroskopie von murinen Musculus cremaster Arteriolen die vasorelaxierende Wirkung der HNO Donatoren bestätigt werden. Es zeigte sich eine Korrelation der Vasorelaxation in vivo mit der Formierung der Inter- sowie Intradisulfidbrücken. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit liefern eine umfassende Charakterisierung der HNO vermittelten Disulfidbrückenbildung in PKGIα und deren Auswirkung auf die Aktivität der Kinase und der daraus resultierenden Vasorelaxation.