Yersinien-induzierte Autophagie: Untersuchung zur Bedeutung potentiell relevanter bakterieller Virulenzfaktoren

Abstract

Pathogene Yersinien überleben und replizieren intrazellulär in Autophagosomen. Die dafür verantwortlichen Mechanismen sind bisher weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Yersinia-Faktoren zu ihrem Einfluss auf die Autophagieinduktion und die Hemmung der Autolysosomenreifung in Yersinien-infizierten epithelialen Zellen untersucht. Zu den untersuchten Yersinia-Mutanten zählten zum einen eigens erzeugte Knockout-Mutanten, bei denen eine Deletion der Gene für die Protease Hrep beziehungsweise für die Phospholipase PldA durch Insertion eines Antibiotikaresistenzgens herbeigeführt wurde. Zum anderen wurden bereits vorhandene Yersinien-Mutanten untersucht. Dabei handelte es sich um Mutanten für das RNA-bindende Protein Hfq, das die bakterielle Genexpression post-transkriptionell beeinflussende Protein CsrA und für das Typ II Proteinsekretionssystem Yts1. Außerdem wurden Yersinien mit Mutationen für die übergeordneten Regulatoren FliA, das Sekretin PilQ, sowie für PhoP untersucht. Alle diese Faktoren haben in früheren Untersuchungen bei Mutanten zu einer veränderten Virulenz bei Infektion mit Yersinien geführt. Als Indikator für Autophagie wurde die Prozessierung des Autophagosom-assoziierten Proteins LC3 mittels Westernblot analysiert. Es wurde ermittelt, dass bei den Mutanten für Hfq und CsrA, sowie für FliA und PhoP die Autophagieinduktion vermindert war. Bei der Mutante für Yts1 war die LC3-Konversion erhöht, was darauf schließen ließ, dass sich ein funktionelles Typ II Sekretionssystem hemmend auf Autophagie auswirkt. Die LC3-Prozessierung bei den Mutanten für Hrep und PldA zeigte sich unverändert zum Ausgangsstamm WA-C. In der Fluoreszenzmikroskopie an GFP-LC3-transfizierten Zellen konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Allerdings waren die Veränderungen in der LC3-Prozessierung im Westernblot eher auf eine veränderte Invasivität der Yersinienmutanten zurück zu führen, als auf eine veränderte Autophagieinduktion. Denn wie bei den Ausgangsstämmen befanden sich bei den Mutanten etwa 50 % der intrazellulären Bakterien in LC3-positiven Kompartimenten. Bei keiner der verwendeten Mutanten konnten fluoreszenzmikroskopisch Bakterien in angesäuerten Kompartimenten dargestellt werden, so dass die untersuchten Yersinia-Faktoren offenbar nicht entscheidend dazu beitragen, die Verschmelzung von Autophagosom und Lysosom zum Autolysosom zu blockieren. Da die von uns untersuchten Yersinia-Faktoren vor allem einen Einfluss auf die Invasivität der Yersinien und nicht auf die Induktion von Autophagie und die Hemmung der Autolysosomenbildung hatten, bleiben die molekularen Mechanismen, die das Überleben von Yersinien in Autophagosomen sichern, zunächst weiter unklar.

Pathogenic Yersinia species can survive and replicate intracellularly in autophagosomes. However, it is yet largely unknown which mechanisms the bacteria use for this purpose. In this dissertation work we analysed different Yersinia factors on their responsibility for the induction of autophagy and the inhibition of autolysosome maturation in infected epithelial cells. On one hand, we analysed knock-out mutants of Yersinia enterocolitica that were specially designed for these investigations. These mutants had either a deletion of the protease Hrep or of the phospholipase PldA due to insertion of an antibiotic resistance cassette in the respective genes. On the other hand, we examined already existing bacterial mutants that were deficient for the RNA-binding protein Hfq, for the protein CsrA that influences bacterial gene expression on a post-transcriptional level, or for the type II secretion system Yts1. Furthermore, we analysed mutants for the global regulatory proteins FliA, the PilQ secretin, as well as for PhoP. In previous studies, all these factors have been shown to influence the virulence of Yersinia. As a marker of autophagy execution, we investigated processing of the autophagosome-associated protein LC3 by Western immunoblotting. It was revealed that Yersinia enterocolitica strains with deletions of Hfq or CsrA, as well as of FliA or PhoP induced less autophagy than the wild type strains. In contrast, the mutant for Yts1 induced more LC3 conversion. This implies that the Yts1 type II secretion system may physiologically inhibit autophagy. The mutants for Hrep and PldA displayed no differences in the processing of LC3 compared to wild type bacteria. By applying GFP-LC3 transfected cells, we could confirm our results in fluorescence microscopy However, it appeared that the differences in the processing of LC3 resulted from distinct abilities of the various mutants to invade cells but not from differential capacities of autophagy induction, since almost 50 % of all intracellular bacteria resided inside LC3-positive compartments irrespective of the investigated mutant or parent strain. For none of the mutants we detected bacteria in acidified vacuoles. Thus, the Yersinia factors studied in this dissertation seem not to be important for blocking the observed fusion of autophagosomes with lysosomes. Since the analysed Yersinia factors affected predominantly the capacity of host cell invasion, but not the induction of autophagy or the inhibition of autolysosome formation, it is hitherto yet unclear which molecular mechanisms ensure the survival of Yersinia in autophagosomes.