Deletion Mapping and Phenotype-Genotype Analysis by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification in German Patients with Williams-Beuren-Syndrome

Abstract

Williams-Beuren-Syndrome is a microdeletion syndrome on 7q11.23. Most of the patients present with a characteristic physical appearance, cardiovascular affections, endocrine problems including growth retardation and learning difficulties on one hand but great affection to music on the other hand. Their particular strength is a very friendly and hypersocial behaviour. WBS emerges as a consequence of a contiguous hemizygous deletion of a gene region that in typical cases comprises ~ 1.54 Mb to ~ 1.85 Mb and spans 26 to 28 genes. Several cases of atypical deletions have been reported. Mostly, WBS occurs as a de-novo deletion but there are also cases of autosomal dominant inheritance. The Williams-Beuren-Syndrome Chromosome Region (WBSCR) is flanked by Low copy repeats (LCR) and therefore is predisposed for misalignment during meiosis. The best explored gene of the WBSCR is ELASTIN (ELN). Its haploinsufficiency is considered to be causative for cardiovascular abnormalities in this syndrome and hereditary supravalvular aortic stenosis, which is a disorder on its own. This thesis aimed at verifying former FISH diagnoses in over 340 German WBS patients with the help of a newer method, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). MLPA is a semi-quantitative PCR-based technique to determine the relative copy number of a DNA site of interest. This study of the largest WBS-cohort in Europe to date resulted in 218 cases, in which the former FISH diagnosis could be verified by MLPA. Four atypical deletions as a basis for potential phenotype-genotype correlations were detected: three long deletions and an exceptionally short one. In addition, fragment analysis was performed to narrow down the approximate size of deletion (1.54 Mb vs. 1.85 Mb) and to detect, if the maternal or paternal allele were deleted. The results nearly fitted the previously published data: approximately 94% presented a small 1.54 Mb deletion. Results regarding the parental inheritance differed slightly from literature: in ~ 59 % (vs. 45 %) the deletion was of maternal and in ~ 41 % (vs. 55 %) of paternal origin. The origin of the deletion is not known to have an effect on the phenotype, whereas atypical deletions can have profound effects, especially regarding neurodevelopmental aspects, e. g. infantile spasms or other epileptic disorders. By SNP array analysis, the approximate breakpoints were narrowed down. The shortest deletion spanned ~ 400 kb (case 4) and had to be considered a case of hereditary supravalvular aortic stenosis instead of WBS. The three other deletions comprised ~ 3.6 Mb (case 1), ~ 4 Mb (case 2) and ~ 6.3 Mb (case 3). The most remarkable clinical feature found in two cases was their shorter stature compared to other WBS patients. A potential (pseudo-)gene candidate causing this phenotype is NSUN5P1. Another patient suffered from infantile spasms. There were some potential candidates for the cause of IS: MAGI2, CALN1, YWHAG, MDH2 and HIP1. Of these, MAGI2 and CALN1 are the most promising, but further research is necessary to enhance knowledge about the potentially deleted genes in atypical WBS patients. FISH, which is widely used until today, seems inferior to MLPA, because it depicts hemizygosity mostly in only one gene (ELN), while MLPA depicts a larger gene region (~ 1.05 Mb) in one step. Commercial WBS MLPA kits are readily available. Array diagnostics should follow if MLPA reveals atypical results allowing detailed genetic counselling for the affected families.

Das Williams-Beuren-Syndrom ist ein Mikrodeletionssyndrom auf Chromosom 7q11.23. Es ist die Folge einer zusammenhängenden, hemizygoten Deletion, die im typischen Fall ~ 1.54 bis ~ 1.85 Mb misst und 26 bis 28 kodierende Gene umfasst. Es gibt zudem auch atypische Deletionen. Die meisten Patienten mit typischem WBS weisen ein charakteristisches Äußeres mit Kleinwuchs, sowie kardiovaskuläre und endokrine Veränderungen, eine Intelligenzminderung bei gleichzeitig ausgeprägter Musikalität und ein überaus freundliches und aufgeschlossenes Wesen auf. In den meisten Fällen entsteht das Syndrom aufgrund einer de-novo Deletion. Der Erbgang ist autosomal dominant. Typischerweise ist die Williams-Beuren-Syndrom Chromosomen-Region (WBSCR) deletiert, welche von Low Copy Repeats (LCR) flankiert wird. Diese sind anfällig für eine fehlerhafte Paarung während der Meiose mit der Folge einer Deletion. Am besten ist das ELASTIN (ELN) Gen erforscht, welches ursächlich für die kardiovaskulären Veränderungen bei WBS Patienten, aber auch für die Entstehung der Hereditären Supravalvulären Aortenstenose (SVAS), einem eigenen Krankheitsbild, ist. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden mehr als 340 mittels FISH gestellte WBS-Diagnosen anhand einer neueren Methode überprüft, der Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Die MLPA ist eine semi-quantitative, PCR basierte Technik zur Erfassung von Kopienzahlvariationen innerhalb eines bestimmten Genabschnittes. Durch die MLPA wurden vier atypische Deletionen entdeckt, die als Grundlage für eine Phänotyp-Genotyp-Korrelation dienten. Diese Untersuchungen des bislang größten WBS-Kollektivs in Europa, lieferten in 218 Fällen das Ergebnis einer hemizygoten Deletion im betroffenen Gen-Bereich. In vier Fällen offenbarten sich dabei atypische Deletionen: Drei längere und eine kurze. Um die ungefähre Deletionsgröße (1.54 Mb vs. 1.85 Mb) und um den maternalen oder paternalen Ursprung der Deletion näher bestimmen zu können, wurde eine Fragment-Analyse durchgeführt. ~ 94 % wiesen eine 1.54 Mb Deletion auf, was den Zahlen in der Literatur entsprach. Die Zahlen bezüglich des Ursprungs der Deletion wichen etwas von den verfügbaren Vergleichszahlen ab: Maternalen Ursprungs waren 59% (vs. 45%) und paternalen Ursprungs 41% (vs. 55%) der Deletionen. Der Ursprung der Deletion wirkt sich nach heutigem Wissensstand nicht auf den Phänotypen aus. Im Gegensatz dazu, führen längere, atypische Deletionen zu einer schwereren klinischen Beeinträchtigung, u. a. durch das Auftreten von Epilepsien. Die Bruchpunkte in den vier atypischen Fällen wurden mittels SNP-Array-Analyse näher bestimmt. Die kürzeste Deletion umfasste ~ 400 kb (Fall 4) und konnte einer hereditären SVAS zugeordnet werden. Die drei anderen Deletionen umfassten ~ 3.6 Mb (Fall 1), ~ 4 Mb (Fall 2) and ~ 6.3 Mb (Fall 3). Das auffälligste Merkmal der Patienten der Fälle 1 und 2 war ihre auch für WBS-Standards geringe Körpergröße. Ein potentieller (Pseudo-)Gen-Kandidat hierfür ist NSUN5P1. Das größte Potential für eine Phänotyp-Genotyp-Korrelation bot Fall 3, da dieser Patient an einer BNS-Epilepsie (Infantile Spasmen) litt. Bezüglich Epilepsien gibt es in der Literatur ebenfalls einige potentielle Gen-Kandidaten: MAGI2, CALN1, YWHAG, MDH2 und HIP1. Die immer noch weit verbreitete FISH-Analyse scheint der MLPA unterlegen zu sein. Mittels FISH wird lediglich ein Gen abgebildet (ELN), während die MLPA insgesamt neun Gene in einer Region von ~ 1.05 Mb erfasst. Kommerzielle MLPA-Kits für WBS sind seit einigen Jahren verfügbar. Da sich mittels MPLA ein erster Hinweis auf eine atypische Deletion zeigen kann, empfiehlt sich in solchen Fällen eine weiterführende Diagnostik mittels Array-Analysen, um die tatsächliche Deletionsgröße bestimmen zu können. Kenntnisse über die deletierten Gene und deren Bedeutung für den Phänotyp sind für die genetische Beratung der Patienten und deren Familie unerlässlich und sollten auch zukünftig Gegenstand intensiver Forschung sein.