Klinische Bedeutung von PALB2 und ABRAXAS1 für das Überleben nach Strahlentherapie von Brustkrebspatientinnen und zelluläre Auswirkungen auf die DNA-Replikation

Abstract

Brustkrebs ist weltweit die häufigste Krebserkrankung der Frau. Treten in Familien gehäuft und bereits in frühem Alter Brust- oder Eierstockkrebserkrankungen auf, so kann dies auf eine genetische Veranlagung für erblichen Brustkrebs hinweisen. Die Mehrzahl der Frauen mit erblichem Brustkrebs trägt eine heterozygote Keimbahnmutation in BRCA1 oder BRCA2. Genomische Untersuchungen konnten verschiedene Keimbahnmutationen in Interaktionspartnern von BRCA1/2 identifizieren, die ebenfalls mit einem erhöhten Brustkrebsrisiko assoziiert sind. Zu diesen Brutkrebsrisikogenen gehören auch PALB2 und ABRAXAS1. BRCA1/2, PALB2 und ABRAXAS1 sind Proteine der Homologen Rekombination (HR), einem DNA-Reparaturmechanismus, der darüber hinaus an der DNA-Schadensantwort und dem Schutz von Replikationsgabeln beteiligt ist. Damit ist die HR von entscheidender Bedeutung für den Erhalt der genomischen Integrität. Die Mechanismen, über die heterozygote Mutationen in HR-Gene zur Tumorentstehung beitragen, sind komplex und insbesondere die Auswirkungen von Mutationen auf den Replikationsgabelschutz noch wenig erforscht. Entsprechend ihrer Rolle als wichtige Interaktionspartner von BRCA1/2 wäre denkbar, dass Mutationen in PALB2 und ABRAXAS1 zu Replikationsdefekten führen. Durch ihre Funktion bei der DNA-Reparatur wäre weiterhin denkbar, dass sich genomische Veränderungen von PALB2 oder ABRAXAS1 auf die Strahlensensitivität von Krebspatienten auswirken. Um die Auswirkungen von PALB2 und ABRAXAS1 auf die klinische Strahlensensitivität zu bestimmen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit in einer Metaanalyse zweier Brustkrebsdatenbanken der Zusammenhang zwischen der mRNA-Expression und der Überlebenszeit generell sowie den Überlebensvorteil nach Strahlentherapie untersucht. Um die Auswirkungen von verschiedenen heterozygoten Mutationen in PALB2 und ABRAXAS1 auf die DNA-Replikation zu untersuchen, wurden in primären, humanen Zelllinien die Replikationsstrukturen auf Nukleotidebene mit der DNA Fiber Assay Technik nachgewiesen. Die Replikation wurde dabei im unbehandelten Zustand, nach Hydroxyurea-induzierter Unterbrechung der Replikation sowie nach DNA-Schädigung durch Bestrahlung untersucht, um die Auswirkung verschiedener Formen von Replikationsstress zu vergleichen. Brustkrebspatientinnen mit dem molekularen Subtyp Luminal-A oder dem klinischen Stadium II hatten keinen Überlebensvorteil durch Strahlentherapie, wenn ihre Tumoren wenig PALB2 exprimieren. Bei einer hohen PALB2-Expression bestand hingegen ein Überlebensvorteil nach Strahlentherapie. Zwischen hoher und niedriger Expression von ABRAXAS1 bestanden keine Unterschiede hinsichtlich des Überlebens nach Strahlentherapie. Möglicherweise haben die PALB2-überexprimierenden Tumoren ein höheres Rezidivrisiko und profitieren daher mehr von einer Strahlentherapie. Die zellulären Mechanismen, über die PALB2 an der Brustkrebsprogression beteiligt sein könnte waren nicht Gegenstand dieser Arbeit und sind noch unklar. Der Zusammenhang zwischen der Expression von HR-Genen wie PALB2, der Tumorprogression und der klinischen Strahlensensitivität sollte weiter untersucht werden. Die PALB2- und ABRAXAS1-Trägerzelllinien zeigten eine vermehrte Initiation von Replikationsursprüngen ohne verringerte Elongationsrate im unbehandelten Zustand. Insbesondere zwischen vier verschiedenen untersuchten Mutationen in PALB2 bestanden deutliche Unterschiede in der Ausprägung dieses Replikationsdefekts. Die klinische Bedeutung dieser Haploinsuffizienz der Replikation für die frühe Tumorentstehung in erblichen Brustkrebspatientinnen sollte in zukünftigen Arbeiten näher untersucht werden. Weiterhin sollten die Mechanismen untersucht werden, über die PALB2 und ABRAXAS1 die Initiation von Replikationsursprüngen und die Elongationsrate beeinflussen. Nach Bestrahlung konnten vermehrt angehaltene Replikationsgabeln in PALB2-Trägern, nicht aber in ABRAXAS1-Trägern beobachtet werden. Nach Behandlung der Zellen mit Hydroxyurea zeigte sich in PALB2-Trägern eine nicht signifikante Verringerung der Elongationsrate sowie eine nicht signifikante Zunahme angehaltener Replikationsgabeln. Dies könnte auf eine Störung des Neustarts angehaltener Replikationsgabeln durch defekten Replikationsgabelschutz hindeuten. ABRAXAS1-Träger zeigten keine Veränderungen, die auf einen beeinträchtigten Replikationsgabelschutz hinweisen. Die Rolle von PALB2 beim Replikationsgabelschutz könnte von Interesse für Tumorentstehung und Therapieansprechen sein und sollte näher untersucht werden.

Breast cancer is the most common cancer in women worldwide. A high frequency of breast or ovarian cancer cases in a family and cases at an early age may indicate a genetic predisposition to hereditary breast cancer. The majority of women with hereditary breast cancer carry a heterozygous germline mutation in BRCA1 or BRCA2. Genomic studies have identified germline mutations in binding partners of BRCA1/2 which are associated with breast cancer susceptibility as well. Among these breast cancer genes are PALB2 and ABRAXAS1. BRCA1/2, PALB2 and ABRAXAS1 are proteins that are known to function in homologous recombination (HR), a DNA repair mechanism that is also involved in DNA damage response and protecting replication fork. Thus, HR is of crucial importance for the maintenance of genomic integrity. The mechanisms by which heterozygous mutations in HR genes contribute to tumorigenesis are complex. Particularly, the effects of mutations on the protection of replication fork are still poorly understood. Given their roles as important interaction partners of BRCA1/2, mutations in PALB2 and ABRAXAS1 could lead to defects of the DNA replication. Due to their function in DNA repair, it is also conceivable that genomic alterations in PALB2 or ABRAXAS1 could affect the radiosensitivity of cancer patients. In order to determine the effects of PALB2 and ABRAXAS1 on clinical radiosensitivity, a meta-analysis of two breast cancer databases was used in this study to investigate the relationship between mRNA expression and survival time in general and the survival benefit after radiotherapy. To study the effects of different heterozygous mutations in PALB2 and ABRAXAS1 on DNA replication, the replication structures at nucleotide level were detected in primary human cell lines using the DNA fiber assay technique. The DNA replication was assessed in the untreated state, after hydroxyurea-induced arrest of the replication and after DNA damage by irradiation in order to compare the effect of different forms of replication stress. Breast cancer patients with the molecular subtype Luminal-A or clinical stage II did not have a survival benefit from radiotherapy if their tumors had a low expression of PALB2. However, there was a survival advantage after radiotherapy if PALB2 expression was high. There was no difference between high and low expression of ABRAXAS1 with regard to survival after radiotherapy. Possibly, patients with PALB2-overexpressing tumors have a higher risk of recurrence and therefore benefit more from radiotherapy. The cellular mechanisms by which PALB2 might be involved in breast cancer progression were not the subject of this work and are still unclear. The interaction between the expression of HR genes such as PALB2, tumor progression and clinical radiation sensitivity should be further investigated. The PALB2 and ABRAXAS1 mutation carrier cell lines showed an increased firing of origins of replication without an effect on the elongation rate in the untreated state. Especially between carriers of the four different mutations in PALB2 that were studies, the replication defects differed strongly. The clinical significance of this haploinsufficiency of replication for the early development of tumors in hereditary breast cancer patients should be investigated in future studies. Furthermore, the mechanisms by which PALB2 and ABRAXAS1 influence the firing of origins of replication and the elongation rate should be investigated. After irradiation, an increase in stalled replication forks could be observed in PALB2 carrier cell lines but not in ABRAXAS1 carriers. After treatment with hydroxyurea, a non-significant reduction of the elongation rate and a non-significant increase of stalled replication forks was observed in PALB2 carriers. This could indicate a disturbance of the restart of stalled replication forks due to defective protection of replication forks. ABRAXAS1 showed no change that would indicate an impaired protection of replication forks. The role of PALB2 in the protection of replication forks could be of interest for tumorigenesis and prediction of therapy response and should thus be further investigated.