Titel: New Insights into Leishmania Stress Tolerance: The Impact of the Small Heat Shock Protein 23 and Casein Kinase 1.2
Sprache: Englisch
Autor*in: Kröber-Boncardo, Constanze
Schlagwörter: Leishmania Stress Toleranz; HSP23; Kasein Kinase 1.2; Leishmania stress tolerance; HSP23; Casein kinase 1.2
Erscheinungsdatum: 2020
Tag der mündlichen Prüfung: 2021-02-12
Zusammenfassung: 
Protozoen der Gattung Leishmania sind die Erreger verschiedener Krankheiten, die kollektiv als Leishmaniosen bezeichnet werden. Je nach Leishmania-Art und Immunstatus des Wirts kommt es zu unterschiedlichen Krankheitsformen, die von spontan heilenden ulzerierenden Hautläsionen bis hin zu disseminierten viszeralen Verläufen reichen. Bis heute stehen keine wirksamen Impfstoffe zur Verfügung und die gegenwärtigen Leishmaniose-Therapien beschränken sich auf teure und/oder toxische Chemotherapien.
Während ihres Lebenszyklus durchlaufen Leishmania Parasiten zwei unterschiedliche Entwicklungsstadien: die extrazelluläre, begeißelte Promastigote in der Sandmücke und die intrazelluläre, unbegeißelte Amastigote innerhalb des Säugetierwirts. Die Differenzierung von Promastigoten zu Amastigoten wird durch die höhere Temperatur und den sauren pH-Wert innerhalb des Phagolysosoms der Wirtsmakrophage induziert. Gleichzeitig kommt es zu einer klassischen zellulären Stressantwort, also einer erhöhten Synthese mehrerer Hitzeschockproteine, darunter auch des kleinen Hitzeschockproteins 23. Dieses Protein wurde zuvor in L. donovani, dem Erreger der viszeralen Leishmaniose, charakterisiert und ist, wie durch den temperatursensitiven (TS) Phänotyp von HSP23-/- Nullmutanten gezeigt wurde [1], essenziell für das Überleben des Parasiten bei erhöhten Temperaturen (37°C). Da keine HSP23 Homologe im Menschen existieren und HSP23 sich zudem strukturell von kleinen Hitzeschockproteinen des Menschen unterscheidet, stellt es einen potenziellen Angriffspunkt für Wirkstoffe dar.
In dieser Arbeit habe ich anhand zweier Fragen die Eignung von HSP23 als möglichen Angriffspunkt für Medikamente analysiert: (i) Ist die essenzielle Funktion von HSP23 in Leishmanien- und den nah verwandten Trypanosoma-Spezies konserviert und (ii) gibt es einen Bypass für das Fehlen von HSP23, der die Fitness und Lebensfähigkeit der Parasiten sowohl bei Umgebungs- als auch bei Säugetiertemperaturen wiederherstellen kann?
Tatsächlich zeigte die Phänotypanalyse von L. major HSP23-/- Nullmutanten den gleichen Stress- und TS Phänotyp wie bereits zuvor die L. donovani HSP23-/- Nullmutanten. Darüber hinaus wurde die konservierte Funktionalität von HSP23 durch Komplementationsstudien bestätigt, die zeigten, dass L. donovani und L. major HSP23-/- Nullmutanten phänotypisch mit HSP23 Transgenen von anderen Trypanosomatiden kompensiert werden können. Zudem berichte ich über die spontane Entstehung einer LdHSP23-/- escape-Variante, LdHSP23-/- esc0. Diese Mutante zeigte (i) ein Wildtyp-ähnliches Wachstum bei permissiven Temperaturen, (ii) eine wiederhergestellte Toleranz gegenüber Ethanol und (iii) eine erhöhte Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid. Eine Selektion bei nicht-permissiven Temperaturen, gefolgt von einer Inkubation bei permissiven Temperaturen, ermöglichte die Selektion von zwei temperaturtoleranten LdHSP23-/- Populationen. Für die Identifizierung der zugrunde liegenden kompensatorischen molekularen Mechanismen führte ich eine vergleichende Analyse der Genome durch, die wesentliche stammspezifische Unterschiede im Zusammenhang mit dem Verlust von HSP23 aufzeigte. Besonders interessant war die selektive, partielle oder vollständige Amplifikation von Chromosom 35, die in allen untersuchten LdHSP23-/- Mutanten zu beobachten war. Ich konnte bestätigten, dass Veränderungen der Chromosomen- und Genkopienzahl, insbesondere aber die massive Amplifikation eines sechs Gene umfassenden Bereichs auf Chromosom 35 in den temperaturtoleranten LdHSP23-/- Mutantenlinien, mit einer erhöhten Transkript- und Proteinabundanz korrelierten. Um die Gene zu identifizieren, die den TS Phänotyp von HSP23-/- Nullmutanten kompensieren, habe ich einen Komplementations-genetischen Ansatz verfolgt, bei dem die jeweiligen Kandidaten kollektiv als Transgene in TS HSP23-/- Mutanten überexprimiert wurden. Nach einer Selektion bei permissiven oder nicht-permissiven Temperaturen wurden aus den selektierten Parasitenkulturen die Überexpressionsplasmide reisoliert und mittels PCR auf das Vorhandensein von Transgenen analysiert. Dabei zeigte sich, dass die Überexpression einer Proteinkinase, der Kaseinkinase 1.2 (LdBPK_351030), notwendig und ausreichend ist, um den TS Phänotyp der HSP23-/- Nullmutanten zu kompensieren. Darüber hinaus wurde durch in vitro Phosphorylierungsexperimente sowohl HSP23 als auch das verwandte P23-Co-Chaperon als Substrate und Modulatoren der Kaseinkinase 1.2 nachgewiesen. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass spontane genetische Anpassungen den Funktionsverlust von HSP23 aufheben können, was HSP23 als Ziel für eine therapeutische Intervention gegen Leishmania-Infektionen ausschließt. Zudem liefert diese Studie Belege für eine entscheidende Verbindung zwischen Chaperonen und Signaltransduktionsproteinkinasen in diesen frühen Eukaryoten und trägt zum Verständnis bei, wie die Trypanosomatida sich an veränderte Bedingungen anpassen.

Protozoa of the genus Leishmania are the causative agents of a spectrum of diseases, collectively known as leishmaniases. Depending on the Leishmania species and the immune status of the host, the clinical manifestations range from spontaneously healing ulcerated skin lesions to disseminated visceral infections. To date, there are no effective vaccines and the current antileishmanial treatments are limited to expensive and toxic chemo-therapies.
During its life cycle, Leishmania parasites alternate between two distinct developmental stages: the extracellular, flagellated promastigote in the insect vector and the intracellular, aflagellated amastigote form inside the mammalian host. The transition from promastigotes to amastigotes is induced by an increase of temperature and the acidic pH, which the parasites encounter within the phagolysosome of the host macrophages. At the same time, the temperature shift also induces a classic cellular stress response, with increased synthesis of several heat shock protein families including the small heat shock protein 23. This protein was recently characterised in L. donovani, the causative agent of visceral leishmaniasis, and was found to be essential at mammalian tissue temperature (37°C) as demonstrated by a bona fide temperature-sensitive (TS) phenotype of HSP23-/- null mutants [1]. Since HSP23 has no homologues in humans and is structurally different from human small heat shock proteins, it was proposed as a potential drug target. In this thesis, I analysed the suitability of HSP23 as drug target by addressing two questions: (i) is the essential function of HSP23 conserved among Leishmania and closely related Trypanosoma species and (ii) is there a bypass for the lack of HSP23 that can restore parasite fitness and viability at both ambient and mammalian temperatures? Indeed, generation and subsequent phenotype analysis of L. major HSP23-/- null mutants revealed the same stress and TS phenotype as observed previously for L. donovani HSP23-/- null mutants. Furthermore, the conserved functionality of HSP23 was confirmed by complementation studies showing that L. donovani and L. major HSP23-/- null mutants could be complemented phenotypically with HSP23 transgenes from a range of trypanosomatids. I further report the spontaneous emergence of an LdHSP23-/- escape variant named LdHSP23-/- esc0. This mutant was characterised by (i) a wild type-like growth at permissive temperatures, (ii) restored tolerance to ethanol and (iii) increased resistance to hydrogen peroxide. A preselection at non-permissive temperatures followed by a recovery period at permissive temperatures further allowed to select for two temperature-tolerant LdHSP23-/- mutant populations. To gain further insights into the compensatory molecular mechanisms, I resorted to comparative genomics which revealed major strain-specific differences associated with the loss of HSP23. Particularly interesting was the selective, either partial or complete, amplification of chromosome 35 that was observed for all investigated LdHSP23-/- mutant lines. I confirmed that somy and gene copy number variations, but in particular the massive amplification of a six-gene cluster on chromosome 35 in the temperature-tolerant LdHSP23-/- mutant lines, correlated well with elevated transcript and protein abundance. To identify the genes involved in rescuing the TS phenotype of HSP23-/- null mutants, I implemented a functional cloning approach in which the respective candidates were collectively over expressed as transgenes in TS HSP23-/- mutants. Following a continuous selection at either permissive or non-permissive temperatures, over expression plasmids were again recovered from the selected parasite cultures and analysed for the presence of transgenes by PCR. This revealed that over expression of a protein kinase, namely casein kinase 1.2 (LdBPK_351030), is responsible and sufficient to rescue the TS phenotype of HSP23-/- null mutants. In addition, in vitro phosphorylation experiments established both HSP23 and the related P23 co-chaperone as substrates and modulators of casein kinase 1.2. In summary, I showed that spontaneous genetic adaptations can overcome the loss of HSP23 function, ruling out HSP23 as a therapeutic target against Leishmania infections. Also, this study provides evidence for a crucial link between chaperones and signal transduction protein kinases in this early-branching eukaryote and contributes to the understanding of how trypanosomatids adapt to changing conditions.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/8897
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-91047
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Clos, Joachim
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

Dateien zu dieser Ressource:
Datei Beschreibung Prüfsumme GrößeFormat  
Dissertation.pdffb7b57b3ff5c77f5770f2fa012aba8c62.02 MBAdobe PDFÖffnen/Anzeigen
Zur Langanzeige

Info

Seitenansichten

255
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 27.03.2024

Download(s)

197
Letzte Woche
Letzten Monat
geprüft am 27.03.2024
Werkzeuge

Google ScholarTM

Prüfe