Structural and functional studies of the alternating access mechanism of secondary active transporters

Abstract

Ziel dieses Projects ist es funktionale und strukturelle Einsichten in den abwechselden Zugriffstransportmechanismus des sekundären aktiven Transporters Mhp1, die Membran Hydantoin Permease-1 aus Microbacterium liquefaciens, der Nukleobasen-cation symporter Familie (NCS-1),zu erlangen. Bisher konnte Mhp1 in drei Konformationen entlang der vermuteten Reaktionskoordinate beobachtet werden(Shimamura et al. 2010). In einem Versuch Mhp1 in zusätzlichen Konformationen einzufangen, wurden verschiedene Mutanten produziert, bei denen Schlüsselaminosäuren der Natrium- und Substrat Bindungstellen verändert wurden. Zunächst wurden Mutanten produziert und charkterisiert, gefolgt von kristallographischen Analysen. Da Mhp1’s Transportmechanismus ein sehr dynamischer Prozess ist, wurden die Einschränkungen eines Kristallgitters umgangen,indem der Mechanismus weiter in Lösung untersucht wurde. Größenausschlusschromatographie in Verbindung mit Kleinwinkelröntgenstreuung wurde verwendet um die konformationelle Homogenität von Mhp1 zu untersuchen. Außerdem wurde ein zweiter Membrantransporter, LeuT aus Aquifex aeolicus, studiert. Die Produktion und Charakterisierung von wild-type LeuT, sowie erste Untersuchungen eines Dreifach-Mutanten für zeitaufgelösten Studien wurden durchgeführt.

This project aimed to provide functional and structural insights into the alternating access transport mechanism of the secondary active transporter Mhp1, the membrane hydantoin permease-1, from Microbacterium liquefaciens of the nucleobase-cation symporter family (NCS-1). Mhp1 has already been observed in three conformational states along the putative reaction coordinate (Shimamura et al. 2010). In an attempt to capture Mhp1 in additional conformations several mutants were produced, where key residues of the sodium and binding cavities of Mhp1 were altered. Initially mutants were produced and characterised, followed by crystallographic analysis. As Mhp1’s mechanism of transport is a highly dynamic process, this mechanism was further investigated in solution, to avoid the crystal packing limitations. Size-exclusion chromatography coupled small angle X ray scattering was employed to probe the conformational homogeneity of Mhp1. A second membrane transporter, LeuT from Aquifex aeolicus, was also studied. The production and crystallisation of wild-type LeuT as well as the first studies of a new triplemutant were performed to enable time-resolved studies.