Evaluation of the impact of microtubule modifications on cMyBP-C and hypertrophic cardiomyopathy

Abstract

The main scientific interests of our group for several years are genetics, pathophysiology and gene therapy of hypertrophic cardiomyopathy (HCM). HCM is an autosomal-dominant disorder characterized by cardiac hypertrophy and dysfunction caused by genetic variants in genes encoding sarcomeric components. Out of them, MYBPC3, encoding cardiac myosin-binding protein C (cMyBPC), is the most frequently mutated one. The group previously developed mouse models of HCM that exhibit low level (knock-in) of or no (knock-out) cMyBP-C and develop cardiomyopathy (Carrier et al. 2004, Vignier et al. 2009). Recent insights point to the importance of microtubule dynamics and α-tubulin posttranslational modifications (e.g. detyrosination) in cardiomyopathy (Kerr et al. 2015, Robison et al. 2016). Specifically, detyrosination of α-tubulin is associated with stable microtubules and cardiomyocyte stiffness. However, the interplay between components of the sarcomere and microtubules has not been evaluated in detail yet. In this work we were interested to measure protein levels of detyrosinated α-tubulin in cardiac tissue derived from HCM patients and from Mybpc3-targeted knock-in mice, our HCM mouse model. Further the effects of pharmacological microtubule modulation were at interest. Finally, we investigated possible interactions between the microtubule network and cMyBP-C as a possible novel anchoring point of the microtubules within the sarcomere. By using Western Blot analysis, we showed significantly elevated protein levels of detyrosinated α-tubulin in cardiac tissue derived from both human HCM and Mybpc3-targeted KI mice, while total α-tubulin protein level remained constant. Further, we established a protocol to induce detyrosination of α-tubulin in isolated AMCMs with paclitaxel, a microtubule-stabilizing drug used in chemotherapy. Via immunofluorescence we stained the microtubule network in AMCMs and visualized an accumulation of detyrosinated α-tubulin in paclitaxel-treated myocytes. Further we set up a model to investigate protein-protein proximity in isolated AMCMs using proximity ligation assay (PLA), which allows for sensitive and specific detection of potential protein complexes. Here we showed a close proximity between cMyBP-C and α-tubulin, especially in its detyrosinated state. Unfortunately, we were not able to include a PLA on the interaction of tyrosinated tubulin, a rat-derived antibody, and cMyBP-C due to a lack of corresponding PLA Probes for our tyrosinated tubulin antibody. In summary we assume cMyBP-C to be a novel anchor protein for the microtubule network in the sarcomere of cardiomyocytes. Treatment with paclitaxel induced α-tubulin detyrosination and increased PLA signal with cMyBP-C. The overall elevated protein levels of detyrosinated α-tubulin along with a potential increased interaction of condensed microtubules and the cMyBP-C anchor within the sarcomere could explained the increased myocardial stiffness and diastolic dysfunction observed in patients suffering from HCM. Whether the increased detyrosination of α-tubulin and therefore interaction of microtubule network and cMyBP-C is a direct result of the frequently disease-associated MYBPC3 genetic variants with an increase in TCP activity or a resulting change in protein conformation with the expression of new or altered binding sites, remains uncertain and should be subject to investigation with a further approach of understanding the role of microtubules and cMyBP-C in HCM in near future.

Seit vielen Jahren widmet sich unsere Arbeitsgruppe der Erforschung von Genetik, Pathophysiologie und Gentherapie der hypertrophen Kardiomyopathie (HCM). Die HCM ist eine autosomal-dominant vererbte Erkrankung charakterisiert durch kardiale Hypertrophie und Dysfunktion, ausgelöst durch Mutationen in verschiedenen Genen, welche für die Expression diverser sarkomerischer Proteine verantwortlich sind. Unter ihnen ist das MYBPC3-Gen, welches für das kardiale Myosin-bindende Protein C (cMyBP-C) kodiert, am häufigsten von Mutationen betroffen (Carrier et al. 2015). Der Arbeitsgruppe ist es gelungen Mausmodelle der HCM zu entwickeln, welche entweder vermindert (knock-in) oder kein (knock-out) cMyBP-C exprimieren und eine Kardiomyopathie entwickeln (Carrier et al. 2004, Vignier et al. 2009). Neuere Erkenntnisse weisen der Dynamik und den posttranslationalen Modifikationen der Mikrotubuli, vor allem der Detyrosinierung, eine relevante Rolle im Rahmen von Kardiomyopathien zu (Kerr et al. 2015, Robison et al. 2016). Vor allem die Detyrosinierung von α-Tubulin führt zu einer Stabilisierung der Mikrotubuli und führt zu myokardialer Versteifung. Bislang liegt jedoch noch keine detaillierte Untersuchung des Zusammenspiels von Bestandteilen des Sarkomers und den Mikrotubuli vor. Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung von detyrosiniertem α-Tubulin in Herzgewebe, welche von Patienten mit HCM oder Mybpc3-gezielten knock-in Mäusen, unserem HCM-Mausmodell, gewonnen wurden. Des Weiteren wurde der Einfluss auf Tyrosinierung nach Tubulin-modifizierender pharmakologischer Behandlung untersucht. Abschließend wurden mögliche Interaktionspunkte zwischen dem Mikrotubuli-Netzwerk and cMyBP-C, als möglicher neuer Ankerpunkt im Sarkomer, untersucht. In dieser Arbeit konnten wir mittels Western Blot Analyse signifikant erhöhte Werte von detyrosiniertem α-Tubulin in Herzgewebe von HCM-Patienten und Mybpc3-gezielten knock-in Mäusen nachweisen, während die Menge an gesamtem α-Tubulin unverändert blieb. Zudem gelang die Etablierung eines Protokolls zur Induktion der Detyrosinierung von α-Tubulin in isolierten adulten Maus Kardiomyozyten (AMCM) mittels Paclitaxel, einer gegen Tubulin gerichteten Substanz, welche auch in der Chemotherapie Anwendung findet. Mit Hilfe von Immunfluoreszenz wurde das Mikrotubuli-Netzwerk in AMCMs gefärbt und so eine Akkumulation von detyrosiniertem α-Tubulin in Paclitaxel-behandelten Myozyten nachgewiesen. In einem weiteren Schritt etablierten wir ein Modell zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in AMCMs mithilfe der Proximity Ligation Assay (PLA)-Methode, welche eine sensitive und spezifische Detektion von Proteinkomplexen sowie eine Visualisierung von individuellen Proteininteraktionen ermöglicht. Hier konnten wir eine bislang unbekannte Interaktion zwischen cMyBP-C und Tubulin aufzeigen, bevorzugt in der detyrosinierten Form. Wir folgern entsprechend, dass cMyBP-C ein weiteres Ankerprotein für das Mikrotubuli-Netzwerk im Sarkomer von Kardiomyozyten sein kann. Behandlung mit Paclitaxel induzierte die Detyrosinierung und somit auch eine Interaktion von cMyBP-C und den Mikrotubuli. Der insgesamt erhöhte Proteingehalt an detyrosiniertem α-Tubulin gemeinsam mit einer vermehrten Interaktion von kondensierten Mikrotubuli und dem cMyBP-C-Anker können eine Erklärung für die erhöhte myokardiale Steifheit sein, welche in HCM-Patienten beobachtet wird. Ob ein erhöhter Anteil an Detyrosination von α-Tubulin und damit eine vermehrte Interaktion zwischen Mikrotubuli-Netzwerk und cMyBP-C eine direkte Folge der häufig krankheitsassoziierten MYBPC3-Mutation mit einer Überregulation der Tubulin Carboxypeptidase (TCP)-Aktivität ist oder eher eine Veränderung der Proteinkonformation mit der Expression neuer oder veränderter Bindungsstellen, bleibt bis dato ungeklärt und bedarf in Zukunft weiterer Untersuchung mit dem Anspruch die Rolle der Mikrotubuli und cMyBP-C in HCM zu verstehen.