Von mesenchymalen Zellen sezernierte extrazelluläre Vesikel protektieren letal bestrahlte hämatopoetische Stammzellen

Abstract

Ionisierende großflächige oder Ganzkörperbestrahlung wie sie bei Strahlenunfällen und Radiotherapie – insbesondere der myeloablativen Konditionierung – vorkommt, gehen mit hohen Mortalitäts- und Morbiditätsraten einher. Ursache dafür sind die auftretenden schweren Nebenwirkungen wie z.B. irreversible Myelosuppression, deren einzige therapeutische Behandlungsmethode bis heute eine mit ebenfalls mit hohen Mortalitäts- und Morbiditätsraten einhergehende Stammzell- oder Knochenmarktransplantation ist. Demzufolge ist eine alternative risikoärmere Behandlungsform der strahlungsinduzierten Nebenwirkungen von besonderer klinischer Bedeutung. Als besonders geeignete Kandidaten für die Protektion letal bestrahlter mHSCs/mHPCs und der damit verbundenen vollständigen Wiederherstellung der Hämatopoese haben sich parakrin wirkende von MSCs sezernierte EVs erwiesen. Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus hinsichtlich der nachgewiesenen Radioprotektion von mMSC-EVs weiter zu entschlüsseln. Dazu gehörte die Identifikation der Zielzellen in vivo sowie die Bestimmung der von den mMSC-EVs transportierten Moleküle (Proteine und RNAs). Darüber hinaus wurden aufgrund ihrer bereits bekannten biologischen Funktion geeignete Protein-Kandidaten ausgewählt, um diese in vitro auf eine mögliche radioprotektive Wirkung zu testen. Die intravenöse Verabreichung PHK26-markierter mMSC-EVs in letal bestrahlte Empfängertiere zeigte, dass die EVs sich frei durch den Körper bewegten und gezielt ins Knochenmark (KM) strömten, wo sie bereits 2 h nach Transplantation detektierbar waren. Dort angekommen kolokalisierten die EVs bevorzugt direkt mit potentiell rekonstitutiven, pluripotenten Stammzellen, welche bekannterweise in Mäusen hoch SCA-1 positiv und nur gering C-KIT positiv sind. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass zum größten Teil nur ein einzelner EV mit einer Stammzelle interagierte und dies möglicherweise bereits für einen protektiven Effekt ausreicht. Die drei anhand einer durchgeführten mMSC-EV Proteomanalyse ausgewählten Kandidaten (SOD1, GAL1 und PRDX1) konnten nachweislich sowohl einzeln, als auch alle drei zusammen erfolgreich auf Transkriptions- und Proteinebene mittels entsprechender lentiviral stabil eingebrachter shRNAs in mMSCs runterreguliert werden. Diese Suppression der Kandidaten spiegelte sich ebenfalls im RNA- und Proteinlevel der von den transduzierten mMSCs sezernierten EVs wider. Dabei ergab es keinen Unterschied, ob die Zellen während der EV-Produktion mit oder ohne Zytokin-Zugabe kultiviert wurden. Die daraufhin durchgeführten Radioprotektionsassays mit den unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen hergestellten mMSC-EVs ließ jedoch auf Grund Assay-untypischer Ergebnisse der mitgeführten Kontroll-EVs keine Aussage hinsichtlich der Beteiligung der drei Kandidaten an der Radioprotektion von mHSCs zu. Auch mit veränderten Assay-Parametern konnte keine Protektion letal bestrahlter mMNCs nachgewiesen werden. Daraufhin durchgeführte Untersuchungen zeigten im Gegensatz zu den früher etablierten mMSCs eine veränderte Expression charakteristischer mMSC-Oberflächenmarker gegenüber den in dieser Arbeit für die Runterregulation mit dazugehörigen Kontrollen verwendeten mMSCs. In wie weit diese Veränderungen einen Einfluss auf die Radioprotektion der EVs besitzt, bleibt abzuklären, ebenso wie die genaue Zuordnung der radioprotektiven Effekte zu einzelnen in EVs enthaltenen Komponenten. Zusätzlich gelang es durch eine Transkriptomanalyse diejenigen RNAs in den mMSC-EVs zu identifizieren, die im Vergleich zu ihren parentalen Zellen signifikant angereichert oder reduziert vorlagen. Diese wurden anschließend anhand ihrer bekannten hauptsächlichen Funktionalität eingruppiert. Insgesamt konnte mit der Entdeckung, dass mMSC-EVs letal bestrahlte mHSCs direkt ansteuern und es keinen Nachweis auf eine indirekte Beteiligung weiterer Zellen an der Protektion gibt, der vorliegende Protektionsmechanismus weiter aufgeklärt werden. Auch die Daten über die von den EVs transportierten RNAs bieten neue Beiträge zur Entschlüsselung einzelner Komponenten des Mechanismus. Somit hat diese Arbeit dazu beigetragen der Entwicklung einer effizienten und sicheren Behandlungsform von schweren strahlungsinduzierten hämatopoetischen Schäden wieder einige Schritte näher zu kommen.

Irradiation of large area or even the whole body with ionizing radiation as it occurs in radiation accidents and radiotherapy - especially myeloablative conditioning - is associated with high mortality and morbidity rates. This is due to the severe side effects that occur, such as irreversible myelosuppression, for which the only therapeutic treatment to this day is stem cell or bone marrow transplantation. These treatments are also associated with high mortality and morbidity rates. Consequently, an alternative lower-risk treatment for radiation-induced side effects is of particular clinical importance. It has been shown that paracrine-acting EVs secreted by MSCs are particularly suitable candidates for the protection of lethally irradiated mHSCs/mHPCs and the associated full restoration of hematopoiesis. The aim of this work was to further unravel the mechanism regarding the afore demonstrated radioprotection of mMSC-EVs. This included the identification of the target cells in vivo, as well as the identification of the molecules (proteins and RNAs) transported by the mMSC-EVs. Furthermore, based on their already known biological function, suitable candidates were selected to be tested in vitro for a potential radioprotective effect. Intravenous administration of PHK26-labeled mMSC-EVs into lethally irradiated recipient animals showed that EVs moved freely through the body and targeted the bone marrow (BM) where they were verifiable as early as 2 h after transplantation. Once there, the EVs preferentially colocalized directly with potentially reconstitutive pluripotent stem cells, which are known to be highly SCA-1 positive and only slightly C-KIT positive in mice. In addition, it was shown that only a single EV interacted with a stem cell for the most part and this single interaction may already be sufficient for a protective effect. The three candidates selected on the basis of a performed mMSC-EV proteomic analysis (SOD1, GAL1, and PRDX1) were shown to be successfully downregulated both individually and all three together at the transcriptional and protein levels using the appropriate with lentiviruses stably into mMSCs introduced shRNAs. This suppression of the candidates was also mirrored on RNA and protein levels of EVs secreted by the transduced mMSCs. There was no difference whether the cells were cultured with or without cytokine addition during EV production. However, the subsequent radioprotection assays with the mMSC-EVs produced under different cultivation conditions did not allow any conclusion regarding the involvement of the three candidates in radioprotection of mHSCs due to assay atypical results of the included control EVs. Even with modified assay parameters, no protection of lethally irradiated mMNCs could be detected. Subsequent investigation showed altered expression of the characteristic mMSC surface markers of the previously established mMSCs compared to those of the mMSCs used for downregulation experiments with associated controls in this work. The extent to which this has an impact on the radioprotection of EVs remains to be elucidated. This applies alike to the radioprotective effects attributed to the individual components present in EVs. In addition, transcriptome analysis identified those RNAs in mMSC-EVs that were significantly enriched or reduced compared to their parental cells. These were subsequently grouped regarding their known major functionality. Overall, the discovery that mMSC-EVs directly target lethally irradiated mHSCs - and that there is no evidence for indirect involvement of other cells in protection – further elucidated the present protection mechanism. Furthermore, the data on RNAs transported by EVs offer new contributions to decipher individual components of this mechanism. Therefore, this work has contributed to the development of an efficient and safe treatment for severe radiation-induced hematopoietic damage.