(Multi-)resistente Pseudomonaden in Lebensmitteln

Abstract

Die vorliegende Arbeit hatte als Ziel neue Erkenntnisse zum Vorkommen (multi-)resistenter Pseudomonaden in handelsüblichen, überwiegend roh verzehrbaren, Lebensmitteln zu gewinnen. Hierzu wurde ein kulturelles Nachweis- und Zählverfahren entwickelt. Mit diesem Verfahren werden nur (multi-)resistente Pseudomonaden erfasst, was eine Unterscheidung zu dem bisher bekannten Verfahren der DIN EN ISO 13720:2010-12 für die Zählung von präsumtiven Pseudomonaden in Fleisch- und Fleischerzeugnissen darstellt. Der Anwendungsbereich konnte mittels Validierung für einen horizontalen Bereich bestätigt werden, sodass das in dieser Arbeit beschriebene Verfahren für jede Lebensmittelmatrix genutzt werden kann. Zudem zeichnet sich dieses kulturelle Nachweis- und Zählverfahren durch eine Inklusivität von 100 % sowie Exklusivität von 73 % aus: Unterschiedliche Spezies der Gattung Pseudomonas zeigen ein gutes Wachstum wohingegen grampositive Bakterien, Hefen und Schimmelpilze und die meisten gramnegativen Bakterien in ihrem Wachstum unterdrückt werden. Für die Spezifität und Sensitivität wurde jeweils ein Wert von 100 % bestimmt. Die Falsch-Negativ- und die Falsch-Positiv-Rate betrugen folglich 0 %. Für die relative Richtigkeit konnte ein Wert von 100 % bestimmt werden. Die Produktivität lag zwischen 0,5 und 2 und der Selektivitätsfaktor betrug 7. Für den eLOD50 wurden je nach Lebensmittelkategorie Werte zwischen 0,6 KbE/25 g und 1,7 KbE/25 g ermittelt. Die Anforderungen der DIN EN ISO 11133:2020-10, DIN EN ISO 16140-2:2016-11 sowie DIN EN ISO 16140-3:2021-06 werden somit ganzheitlich erfüllt. Zusammenfassend wurde das hier beschriebene Verfahren für die Untersuchung von 184 handelsüblichen Lebensmittelproben genutzt. Diese setzten sich aus den Warengruppen Fleisch, Fisch, Milchprodukte und pflanzliche Lebensmittel zusammen. Bezogen wurden alle Lebensmittel aus diversen Supermärkten in Schleswig-Holstein und Hamburg oder in Zusammenarbeit mit den Lebensmittelkontrolleuren und dem Institut für Hygiene und Umwelt aus unterschiedlichen Restaurants und Eiscafés der Stadt Hamburg. Dabei wurden aus der Hälfte der untersuchten Proben (92 Proben, entspricht 50 %) Pseudomonaden gewonnen. Insgesamt gelang es aus den genannten 92 Proben 211 präsumtiv (multi-)resistente Pseudomonaden nachzuweisen und zu isolieren. Dabei zeigten die Warengruppen rohes Hackfleisch und pflanzliche Lebensmittel mit teilweise mehr als 1000 KbE/g die höchsten quantitativen Keimgehalte. Werden die Ergebnisse der qualitativen Speziesbestimmungen betrachtet, wurde die Spezies P. fulva mit 68 von 211 Isolaten (entspricht 32 %) am häufigsten isoliert. Gefolgt von P. aeruginosa mit 32 Isolaten (entspricht 15%) und P. putida mit 26 Isolaten (entspricht 12 %). Zusammengefasst wurden 22 unterschiedliche Pseudomonaden-Spezies nachgewiesen. Hinsichtlich der einzelnen untersuchten Lebensmittelwarengruppen zeigten sich zudem, in Bezug auf den Anteil der Proben aus denen die jeweiligen Spezies isoliert wurden, deutliche Unterschiede: In der Warengruppe Hackfleisch wurde die Spezies P. fragi mit einem Anteil von 18 % aus den meisten Proben gewonnen. In den Warengruppen Sahne und Lachs war es die Spezies P. fulva mit 17 % bzw. 16 %. P. koreensis wurde in den untersuchten pflanzlichen Lebensmitteln in 18 % und in der Kategorie „diverse weitere Lebensmittel“ in 13 % der untersuchten Proben nachgewiesen. Bei den untersuchten weiteren Fischproben (ohne Lachs) konnte P. putida mit 18 % der Proben am häufigsten isoliert werden. Alle 211 Isolate sowie 26 Isolate einer für diese Arbeit zur Verfügung gestellten Sammlung aus weiteren Pseudomonaden wurden hinsichtlich ihrer minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) untersucht. Es wurden die Antibiotika Imipenem, Ciprofloxacin und Netilmicin gewählt. Diese waren bereits Teil der Nährmedien des kulturellen Nachweis- und Zählverfahrens und decken die Antibiotikagruppen Carbapeneme, Fluorchinolone und Aminoglykoside ab. Dadurch wurden MHKs einer großen Bandbreite von Pseudomonaden bestimmt, insbesondere aus Lebensmitteln. Die Stämme der Spezies P. aeruginosa, der P. fluorescens-Gruppe und ein Isolat der Spezies P. putida wiesen MHKs auf, welche den jeweiligen ECOFFs entsprachen bzw. über diesen Werten lagen. In der Warengruppe Hackfleisch waren die resistenten Pseudomonaden am häufigsten nachzuweisen. Zur Sequenzanalyse der möglichen Resistenztypen und der Klonalität der Stämme, wurden alle 33 Isolate der Spezies P. aeruginosa und das resistente Isolat der Spezies P. putida dem Next Generation Sequencing unterworfen. Für zehn P. aeruginosa Isolate wurde das Gerät der Firma PacBio® für die Sequenzierung genutzt, die übrigen 23 Isolate der Spezies P. aeruginosa sowie das eine P. putida-Isolat wurden mit Hilfe des Gerätes MiSeq® der Firma Illumina® analysiert. Hierbei konnten auf Grundlage der Sequenzanalysenprogramme Bakcharak (Version 2.0), MultiQC (Version 1.9) und ABRicate (Version 1.0.1) die Resistenzgene ausgewertet werden. Es zeigten sich Gene, welche für die Resistenzen gegenüber Imipenem (Gruppe der Carbapeneme), Ciprofloxacin (Gruppe der Fluorchinolone) und Netilmicin (Gruppe der Aminoglykoside) verantwortlich sind. Die drei Resistenztypen traten jedoch nicht immer gleichzeitig bei den Isolaten auf. Mit Hilfe der durch MLST bestimmten Sequenztypen wurden Cluster eng verwandter Stämme ermittelt, insbesondere solcher aus denselben Lebensmittelproben oder aus demselben Betrieb. Zudem wurden durch weitere phylogenetische Sequenzanalyseprogramme Stammbäume auf Basis des cgMLST und der SNPs sowie Distanzmatrices erstellt und die engen Verwandtschaftsverhältnisse der Cluster bestätigt. Die Nukleotiddifferenzen lagen innerhalb der Cluster bei 0 bis 6.

The aim of the present work was to gain new insights into the occurrence of (multi-)resistant pseudomonads in commercially available food. The focus was on samples which can be consumed mostly raw. For this purpose, a cultural detection and enumeration method was developed. Only presumptively (multi-)resistant pseudomonads are detected with this method, which is a difference to the previously known method DIN EN ISO 13720:2010-12 for counting pseudomonads in meat and meat products. The scope of application could be confirmed by horizontal validation. Therefore, the method can be used for any food matrix. In addition, the method described in this work is characterized by an inclusivity of 100 % and an exclusivity of 73 %. Different species of pseudomonads show good growth, whereas gram-positive bacteria, yeasts and mold as well as most gram-negative bacteria are suppressed in their growth. For the specificity and sensitivity, a value of 100 % was determined. In conclusion the false negative and false positive rates were 0 %. The relative accuracy was 100 %. The productivity lay between 0,5 and 2 and the selectivity factor was 7. Values between 0,6 CFU/25 g and 1,7 CFU/25 g were determined for the eLOD50. The criteria of DIN EN ISO 11133:2020-10, DIN EN ISO 16140-2:2016-11 and DIN EN ISO 16140-3:2021-06 are therefore fully met. In summary the developed method was used to examine 184 food samples at consumer level. These consisted of the product groups: meat, fish, dairy products and plant-based foods. All food samples were obtained from various supermarkets in Schleswig-Holstein and Hamburg or (in cooperation with the food inspectors and the Institute for Hygiene and the Environment) from various restaurants and ice cream parlours in the city of Hamburg. Presumptively (multi-)resistant pseudomonads were detected and isolated from half of the samples (92 samples, corresponding to 50 %). A total of 211 presumptively (multi-)resistant pseudomonads were detected and isolated from the 92 samples mentioned. The raw ground meat and plant-based food product groups showed the highest numbers of the samples examined (up tp 1000 CFU/g). From a qualitative point of view, the species P. fulva was isolated most frequently with 68 out of 211 isolates (corresponding to 32 %), followed by P. aeruginosa with 32 isolates (corresponds to 15 %) and P. putida with 26 isolates (corresponds to 12 %). In total, 22 different pseudomonad-species were detected. With regard to the individual food product groups examined, there were also distinct differences in the proportion of samples from which the respective species were isolated: In the ground meat samples, the species P. fragi was isolated from most samples (corresponds to 18 %). In the cream and salmon product groups, it was the species P. fulva with 17 % and 16 %. P. koreensis was detected in most plant-based samples (corresponds to 18 %) and various other foods (13 %) tested. In the additional fish samples (without salmon) the species P. putida could be isolated from 18 % of samples. All 211 isolates and 26 isolates from a collection of other pseudomonads considered for this work were examined for their minimum inhibitory concentrations (MIC). The antibiotics imipenem, ciprofloxacin and netilmicin were chosen. The antibiotics mentioned were already ingredients of the culture media of the culture detection and enumeration procedure and cover the antibiotic groups carbapenems, fluoroquinolones and aminoglycosides. This enabled the determination of MICs of a broad spectrum of pseudomonads, especially from food. The strains of the species P. aeruginosa, the P. fluorescens-group and one isolate of the species P. putida showed MICs which corresponded or exceeded the respective ECOFF. For the sequence analysis of the potential resistance gene types and the clonality of the strains, all 33 isolates of the P. aeruginosa species and the resistant isolate of the P. putida species were subjected to Next Generation Sequencing. For ten P. aeruginosa isolates the PacBio® device was used for sequencing. The remaining 23 isolates of the species P. aeruginosa and the resistant P. putida isolate were analysed using the MiSeq® device from Illumina®. The resistance gene types were determined on the basis of the sequence analysis programs Bakcharak (version 2.0), MultiQC (version 1.9) and ABRicate (version 1.0.1). Genes responsible for resistance to imipenem (carbapenem group), ciprofloxacin (fluoroquinolone group) and netilmicin (aminoglycoside group) were detected. The three types of resistance did not always occur simultaneously in the isolates. Using the sequence types determined by MLST, clusters of closely related strains were identified, especially those from the same food samples or from the same company. In addition, phylogenetic tress based on cgMLST and SNPs as well as distance matrices were constructed by further phylogenetic sequence analysis software and the close relationships of the clusters were confirmed. The nucleotide differences within the clusters ranged from 0 to 6.