Titel: Untersuchungen zur Wirkung von AKT- und mTOR-Inhibitoren auf das Wachstum von EpCAM+- und CD90+-Tumorstammzellen beim hepatozellulären Karzinom
Sprache: Deutsch
Autor*in: Riebandt, Leonie
Schlagwörter: HCC; Tumorstammzellen; PI3K/AKT/mTOR-Signalweg; RAD001; MK-2206; zielgerichtete Therapie
GND-Schlagwörter: LeberzellkrebsGND
SignaltransduktionGND
OnkologieGND
LeberkrebsGND
TherapieGND
Erscheinungsdatum: 2022
Tag der mündlichen Prüfung: 2023-02-16
Zusammenfassung: 
Nach dem gegenwärtigen Modell sind Tumorstammzellen (TSZ) an der Initiierung, Progression, Metastasierung und Chemoresistenz des hepatozellulären Karzinoms (HCC) beteiligt. Der PI3K/AKT/mTOR-Signalweg spielt eine wichtige Rolle in der Biologie von TSZ und ist in circa 50% der HCCs konstitutiv aktiviert. Die Moleküle dieses Signalweges scheinen daher geeignete targets zu sein, um TSZ selektiv zu eliminieren. Aufgrund der Einbindung von mTOR in einen negativen feedback loop führt eine mTOR-Inhibition jedoch zu einer Aktivierung von AKT. Eine Kombinationstherapie mit dem mTOR-Inhibitor RAD001 und dem AKT-Inhibitor MK-2206 zeigte sowohl in vitro als auch im subkutanen Mausmodell in vivo eine synergistische Hemmung des Wachstums von etablierten HCC-Zelllinien (Grabinski et al., 2012). Ob diese Therapie auch das Wachstum orthotop transplantierter HCC-Zellen, insbesondere das primärer TSZ von HCC-Patienten, hemmen kann, ist nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es nun, die Wirkung einer RAD001/MK-2206-Therapie auf das Wachstum der HCC-Zelllinie Huh7 in einem orthotopen Mausmodell zu untersuchen und die Methode zur Anreicherung von EpCAM+- und CD90+-TSZ aus frischem Tumorgewebe zu etablieren.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine RAD001/MK-2206-Therapie zu einer Hemmung des Wachstums von orthotop transplantierten EpCAM+ Huh7-Luc Zellen führt. Jedoch kam es bereits 7 Tage nach Therapiebeginn zu einer Resistenzentwicklung in den Tumorzellen, die insbesondere auf einen Verlust der Wirkung des AKT-Inhibitors MK-2206 zurückzuführen war.
Weiterhin erfolgte eine vergleichende Analyse dreier nicht-invasiver Messmethoden zur Verfolgung von orthotop transplantierten HCC-Zellen in der Maus. Das Alpha-Fetoprotein (AFP)-Level im Serum der Mäuse korrelierte mit den Messwerten des Biolumineszenzimagings (BLI) und der Sonografie. Zudem erwies sich die Bestimmung des AFPs neben dem BLI deutlich sensitiver als die Sonografie.
Weiter wurde die Anreicherung primärer EpCAM+- und CD90+-TSZ aus frisch gewonnenem HCC-Gewebe untersucht. Die Herstellung der Einzelzellsuspension im kombiniert mechanisch-enzymatischen Verfahren mittels gentleMACS-Dissociator und Inkubation mit dem Human Dissociation Kit hatte keinen Einfluss auf die Expression von EpCAM und CD90. Zudem funktionierte die Anreicherung EpCAM+-TSZ mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) sehr gut, während sich die der CD90+-TSZ als weniger effizient erwies. Nach orthotoper Transplantation der HCC-Linie Huh7 in NSG-Mäuse konnten aus einem Maustumor EpCAM+-TSZ angereichert werden.
Vor weiterführenden Untersuchungen zur Wirkung einer RAD001/MK-2206-Therapie auf das Wachstum von magnetisch angereicherten EpCAM+- und CD90+-TSZ von HCC-Patienten im orthotopen Mausmodell müsste die magnetische Anreicherung der CD90+-Zellen weiter optimiert werden. Außerdem wäre es sinnvoll zu untersuchen, ob eine Kultivierung der TSZ im Anschluss an die magnetische Anreicherung unter nicht-adhärenten Bedingungen zur Ausbildung von Sphäroiden führt, die möglicherweise nach Transplantation in Mäusen besser anwachsen. Zudem müsste der molekulare Mechanismus der Resistenzentwicklung gegen die Inhibitoren aufgeklärt werden, um besseres therapeutisches Ansprechen dieser bereits in der Klinik eingesetzten Inhibitoren zu erlangen.

According to the current model, cancer stem cells (CSCs) are involved in the initiation, progression, metastasis, and chemoresistance of hepatocellular carcinoma (HCC). The PI3K/AKT/mTOR pathway plays an important role in the biology of CSCs and is constitutively activated in circa 50% of HCCs. Molecules of this pathway therefore appear to be suitable targets to selectively eliminate CSCs. However, due to the involvement of mTOR in a negative feedback loop, mTOR inhibition leads to activation of AKT. Combination therapy with the mTOR inhibitor RAD001 and the AKT inhibitor MK-2206 showed synergistic inhibition of the growth of established HCC cell lines both in vitro and in a subcutaneous mouse model in vivo (Grabinski et al., 2012). Whether this therapy can also inhibit the growth of orthotopically transplanted HCC cells, in particular the growth of primary CSCs from HCC patients, is not known. The aim of the present work was now to investigate the effect of RAD001/MK-2206 therapy on the growth of the HCC cell line Huh7 in an orthotopic mouse model and to establish the method to enrich EpCAM+ and CD90+ CSCs from fresh tumor tissue.
The results of this work show that RAD001/MK-2206 therapy leads to inhibition of growth of orthotopically transplanted EpCAM+ Huh7-Luc cells. However, resistance development in tumor cells occurred as early as 7 days after therapy initiation, which was particularly due to a loss of effect of the AKT inhibitor MK-2206.
Furthermore, a comparative analysis of three non-invasive measurement methods for tracking orthotopically transplanted HCC cells in mice was performed. The alpha-fetoprotein (AFP) level in the serum of the mice correlated with bioluminescence imaging (BLI) and sonography measurements. Moreover, determination of AFP in addition to BLI proved to be significantly more sensitive than sonography.
Further, the enrichment of primary EpCAM+ and CD90+ CSCs from freshly obtained HCC tissue was investigated. Preparation of the single-cell suspension by the combined mechanical-enzymatic method using gentleMACS Dissociator and incubation with the Human Dissociation Kit had no effect on the expression of EpCAM and CD90. In addition, the enrichment of EpCAM+ CSCs by magnetic activated cell sorting (MACS) worked very well, whereas that of CD90+ CSCs proved to be less efficient. After orthotopic transplantation of the HCC line Huh7 into NSG mice, EpCAM+ CSCs could be enriched from a mouse tumor.
Before further studies on the effect of RAD001/MK-2206 therapy on the growth of magnetically enriched EpCAM+ and CD90+ CSCs from HCC patients in the orthotopic mouse model, the magnetic enrichment of CD90+ cells would need to be further optimized. In addition, it would be useful to investigate whether culturing the CSCs following magnetic enrichment under nonadherent conditions would lead to the formation of spheroids that might grow better after transplantation into mice. In addition, the molecular mechanism of resistance development to the inhibitors would need to be elucidated to obtain better therapeutic response of these inhibitors already used in the clinic.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/10179
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-108154
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Jücker, Manfred
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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