Transgenerational effects on the metabolism of the European sea bass (Dicentrarchus labrax) in the context of ocean acidification and warming

Abstract

In den unterschiedlichen Teilen meiner Doktorarbeit habe ich die Kapazitäten des aeroben Stoffwechsels des Europäischen Wolfsbarsches, Dicentrarchus labrax, bei aktuellen und zukünftigen Bedingungen unter Ozeanversauerung und –erwärmung (OAW) untersucht. Ich wollte einen breitgefächerten Überblick über den aeroben Stoffwechsel des Europäischen Wolfsbarschs bekommen und habe daher mit verschiedenen Entwicklungsstadien (Larven und Juvenile) gearbeitet. Während ich bei den Larven am ganzen Tier gearbeitet habe, habe ich bei den Juvenilen an verschiedenen biologischen Organisationsstufen (Metabolom, Mitochondrien und Ganztierebene) gearbeitet um einen tieferen Einblick in den aeroben Stoffwechsel dieses Entwicklungsstadiums zu erhalten. Zudem habe ich die Ergebnisse der Respirometrie- und Wachstumsdaten von „meinen“ juvenilen Europäischen Wolfsbarschen mit Daten aus ähnlichen Experimenten an der Elterngeneration verglichen. Meine Doktorarbeit war Teil des FITNESS-Projektes (Fish Transgenerational adaptive Strategies to ocean acidification and warming), das erlaubte mir an zwei Gruppen des Europäischen Wolfsbarsches zu arbeiten und zudem die Ergebnisse aus einer Dritten für meine Studien zu benutzen: • Gruppe 1 oder F0 wurde bereits vor meiner Doktorarbeit unter drei Ozeanversauerungsbedingungen (OA) aufgezogen und gehältert. Diese Gruppe ist die Elterngeneration einer „meiner“ Gruppen. Ich konnte die Ergebnisse der Respirometrie- und Wachstumsexperimente, also basale Stoffwechselraten (SMR), kritische Sauerstoffkonzentration (PO2crit) und Wachstumsraten, nutzen, um sie mit den Daten zu vergleichen, die ich aus ähnlichen Experimenten an Gruppe 2 erhalten habe. • Gruppe 2 oder F1 war die Nachwuchsgeneration von F0. Die Eier dieser Generation wurden unter den OA Bedingungen der jeweiligen Elterngeneration gehältert. Um auch Ozeanerwärmung (OW) in die Versuche an dieser Generation mit aufzunehmen, wurden zwei Temperaturen in der Larvenhälterung verwendet, beginnend zwei Tage nach dem Schlupf. Auch wenn das Versuchsdesign kein vollständiges faktorielles Transgenerationsdesign ist, so erlaubte mir dieses Design dennoch einzuschätzen, wie sich die Kapazität sich den ändernden Bedingungen anzupassen ändert, wenn zwei aufeinanderfolgender Generationen diesen Bedingungen ausgesetzt sind. • Gruppe 3 oder Wild war „meine“ zweite Gruppe. Die Fische kamen aus einer Aquakulturanlage und waren der Nachwuchs von wildgefangenen Europäischen Wolfsbarschen. Diese Gruppe wurde unter sechs OAW (zwei OA Bedingungen mit 3 OW Bedingungen gekreuzt) Bedingungen aufgezogen und gehältert, beginnend zwei Tage nach dem Schlupf. Ich habe diese Gruppe für meine Experimente an Mitochondrien und dem Metabolom genutzt und die gewonnenen Daten mit den Wachstumsdaten der Tiere verglichen. Die angewendeten OAW Bedingungen waren wie folgt definiert: Drei OA Bedingungen: • A: die heutigen Umgebungsbedingungen in küstennahen Gewässern der Bretagne und in der Rade von Brest (ca. 650 µatm CO2) • Δ500: ein Szenario, welches den Vorhersagen des SSP3-7.0 des IPCC (2021) folgt (heutige Bedingungen plus 500 µatm CO2, ca. 1150 µatm CO2) • Δ1000: ein Szenario nach SSP5-8.5 (heutige Bedingungen plus 1000 µatm CO2, ca. 1700 µatm CO2) Die F1 Fische wurden nur unter den A und Δ1000 Bedingungen gehältert. Temperaturbedingungen der F0 Fische: • Hälterung der Larven: 19 °C • Hälterung der Juvenilen: aktuelle Umgebungstemperaturen, jedoch immer über 12 °C gehalten Zwei Temperaturbedingungen von OW in F1 und Wild: • „Kaltes“ (C) Szenario: o Hälterung der Larven: 15 °C o Hälterung der Juvenilen: aktuelle Umgebungstemperaturen (bis zu 18 °C), jedoch immer über 15 °C gehalten • „Warmes“ (W) Szenario: o Hälterung der Larven: 20 °C o Hälterung der Juvenilen: Kaltes Szenario + 5 °C Beide OW Bedingungen wurden auf alle OA Bedingungen in F1 und Wild angewendet. Es gab daher die folgenden Gruppen: C-A, C-Δ500 (nur Wild), C-Δ1000, W-A, W-Δ500 (nur Wild) and W-Δ1000. Das Ziel meiner Arbeit war es die folgenden Fragen zu beantworten: (1) Ist die Leistungsfähigkeit von Mitochondrien aus den Herzen von juvenilen Wolfsbarschen nach Langzeitakklimation zu OAW oder nach akuten Temperaturänderungen beeinträchtigt? Meine Hypothesen waren: a. LEAK Respirationsraten sind nach akuter Erwärmung erhöht, da die Mitochondrienmembranen durch die Temperatur beschädigt sind, was zu einer verschlechterten Leistungsfähigkeit von Mitochondrien führt. b. Veränderungen der Eigenschaften der Mitochondrienmembranen nach Langzeitakklimation führen zu reduzierten LEAK Respirationsraten und damit zu wiederhergestellten mitochondrialen Respiratorischen-Kontrollraten c. Erhöhte intrazelluläre PCO2- und Bikarbonatkonzentrationen verschlechtern den mitochondrialen Stoffwechsel, z.B. indem sie die Zitratsynthase oder Succinatdehydrogenase inhibieren. (2) Führt OAW zu synergistischen Effekten auf die Wachstumsraten von Wolfsbarschlarven und –juvenilen? Meine Hypothesen waren: a. Wachstumsraten von Larven und Juvenilen des Europäischen Wolfsbarsches sind unter OW erhöht. b. Wachstumsraten von Larven und Juvenilen des Europäischen Wolfsbarsches sind unter OA unverändert. c. Synergistische Effekte von OAW könnten die Wachstumsraten von Larven und Juvenilen des Europäischen Wolfsbarsches verschlechtern. (3) Führt OAW zu synergistischen Effekten auf die Stoffwechselraten von Larven und Juvenilen des Europäischen Wolfsbarsches? Meine Hypothesen waren: a. RMR der Larven und SMR der Juvenilen wird unter OW erhöht sein. b. Stoffwechselraten von Larven und Juvenilen wird unter OA nicht verschlechtert sein. c. Weder OA, noch OW, noch OAW werden PO2crit der Juvenilen verändern. (4) Verbessert transgenerationale Plastizität beim Europäischen Wolfsbarsch die Wachstums- und Stoffwechselraten von F1 bei OAW nach Akklimierung von F0 an OA? Meine Hypothesen waren: a. F0 und F1 W Larven werden ähnliche Wachstumsraten zeigen (Hälterungstemperatur 19 °C, bzw. 20 °C). b. F0 und F1 C Juvenile werden eine ähnliche Größe bei 3000 dd haben (aktuelle Umgebungstemperatur in beiden Generationen). c. F0 und F1 C Juvenile werden ähnliche SMR haben. d. Wachstums- und Stoffwechselraten von F1 Larven und Juvenilen werden durch OA nicht verschlechtert. (5) Kann man Veränderungen, die beim Wachstum, in den Stoffwechselraten und in der mitochondrialen Funktion beobachtet werden, auch im Metabolom wiederfinden? Meine Hypothesen waren: a. Durch OW erhöhte Wachstumsraten spiegeln sich in erhöhter Proteinsynthese in Muskel- und Lebergewebe wieder. b. Die Konzentrationen von Metaboliten, die in der Erhaltung der Homöostase involviert sind, wie organische Säuren und Osmolyte, werden durch OA verändert, vor allem in der Kieme. c. Veränderungen der Metabolitprofile werden die synergistischen Effekte von OAW wiederspiegeln.

Kapitel 2 befasst sich mit der ersten Frage: Ich habe die mitochondrialen Kapazitäten in permeabilisierten Herzfasern von Wild Juvenilen untersucht. Akute Erwärmung um 5 °C führte zu signifikant erhöhten mitochondrialer LEAK Respiration in den Mitochondrien von Wild C Juvenilen. Das zeigt, dass bereits relativ kleine Temperaturansteige eine Herausforderung für die Mitochondrien im Herzen sein können. Während diese akute Temperaturerhöhung die mitochondriale Funktion beeinträchtigt hat, zeigten die Mitochondrien von warmakklimierten Tieren eine verbesserte Funktionalität, z.B. durch erhöhte respiratorische Kontrollverhältnisse (RCR). Diese verbesserten Kapazitäten spiegelten sich in höheren Wachstumsraten der Wild W Juvenilen wieder. OA beeinflusste weder die Respirationsraten von Komplex I und IV des Elektronentransportsystems, noch die RCR. Zudem konnte eine signifikante Hemmung des Komplexes II durch OA nur in den Wild W juvenilen beobachtet werden, wenn die Herzfasern zusätzlich einer akuten Temperaturverminderung (um 5 °C) ausgesetzt waren. Um die zweite Fragestellung meiner Doktorarbeit zu bearbeiten analysierte ich die Wachstumsraten von F0 und F1 Larven und Juvenilen in Kapitel 3 und verglich sie. Des Weiteren analysierte ich die Wachstumsraten von Wild Larven und Juvenilen in Kapitel 4. OW als alleiniger Stressfaktor erhöhte die Wachstumsraten von Wild und F1 Larven und Juvenilen. OA als alleiniger Stressfaktor veränderte die Wachstumsraten von F0, F1 und Wild Larven und Juvenilen nicht. Die Verbindung von beiden Stressfaktoren führte allerdings zu deutlich kleineren F1 W-Δ1000 Larven, im Vergleich zu allen anderen Larven, zum Zeitpunkt der Metamorphose. Dies konnte so nicht in den Larven und Juvenilen der Wild Gruppe beobachtet werden. In der F0 Gruppe konnte der Effekt von OAW durch die fehlende OW Bedingung nicht untersucht werden. F1 W-Δ1000 Juvenile zeigten ebenfalls erhöhte Wachstumsraten im Vergleich zu F1 C Juvenilen. Da die F1 W-A Bedingung in den Juvenilen fehlte, lässt sich hier allerdings nicht sagen, ob die schädlichen Einflüsse von OAW, die in F1 Larven beobachtet wurden, in der Juvenilen weiter Bestand hatten und nur durch die Effekte von OW auf das Wachstum maskiert wurden, oder nicht. Dennoch deuten diese Daten an, dass es in den Larven der zweiten Generation unter OA Bedingungen eine Diskrepanz gibt, die entweder durch Transgenerationseffekte ausgelöst sein kann oder durch Plastizität während der Entwicklung, da die F1 Fische die einzige Gruppe in dieser Arbeit sind, welche von der Befruchtung an unter OA Bedingungen gehältert wurde. Um die dritte Frage zu beantworten habe ich die Stoffwechselraten (RMR) von F1 Larven des Europäischen Wolfbarsches, sowie die basalen SMR und PO2crit von F1 Juvenilen bestimmt. SMR und PO2crit wurden vor meiner Arbeit auch in F0 Juvenilen gemessen und ich konnte diese Daten nutzen, um sie mit den F1 Tieren zu vergleichen. OA als alleiniger Stressfaktor hatte keinen Einfluss auf die untersuchten Stoffwechselprozesse. PO2crit wurde nicht von OAW beeinflusst. Der Einfluss von OW als alleiniger Stressfaktor konnte in diesen Experimenten nicht untersucht werden, da es keine F1 W-A Juvenilen gab. Die SMR waren in den F0 Juvenilen am niedrigsten, gefolgt von den F1 C Juvenilen und dann den F1 W-Δ1000 Juvenilen. Die niedrigen SMR in F0 könnten durch die unterschiedlichen Temperaturen während der Larvenentwicklung hervorgerufen sein. Während die F1 C Tiere durchgängig bei 15 °C gehältert wurden, wurden die F0 Tiere während der Larvenentwicklung bei 19 °C gehältert und erst nach der Metamorphose bei 15 °C. Die höheren SMR von F1 W-Δ1000 Juvenilen wiederum bestätigen die Ergebnisse aus den RMR der Larven: F1 W Larven hatten höhere RMR als F1 C Larven. Dieser Anstieg der Stoffwechselraten wurde auch in anderen Studien an dieser und an anderen Fischarten gefunden und spiegelte sich in den erhöhten Wachstumsraten von F1 W Larven und F1 W-Δ1000 Juvenilen im Vergleich zu den F1 C Larven, bzw. F1 C Juvenilen wider. Auch wenn die Daten schon in den vorherigen Fragestellungen Verglichen wurden, diente Frage 4 dazu einen möglichst vollständigen Vergleich zwischen F0 und F1 anzustellen und die transgenerationale Plastizität zu untersuchen. Allerdings wurde innerhalb des FITNESS Projektes entschieden, dass zusätzlich ein OW Szenario auf F1 angewendet werden sollte, wie es auch in Wild, aber nicht F0 der Fall war. Da sowohl die Larvenanzahl, als auch Platz und Arbeitskraft begrenzt war, lief diese Entscheidung zu Lasten eines vollständigen Versuchsplan des Transgenerationsexperiments. Damit war es nicht möglich die TGP des Wolfsbarsches zu bestimmen. Dennoch kann der Vergleich von F0 und F1 wichtige Hinweise auf die Kapazität von zwei aufeinanderfolgenden Generationen bei den gleichen OA Bedingungen zu überleben liefern: Während OA als alleiniger Treiber weder F0 Δ1000 Larven (bei 19 °C gehältert) noch F1 C- Δ1000 Larven (bei 15 °C gehältert) beeinflusst hat, waren F1 W- Δ1000 Larven (bei 20 °C gehältert) signifikant kleiner als alle anderen Larven bei der Metamorphose. Diese schädlichen Effekte von OAW auf F1 W- Δ1000 Larven schienen nicht mit der Versorgung der Larven durch die Eltern zusammenzuhängen, da die Larven aus allen OAW Bedingungen in F1 zum Zeitpunkt der Mundöffnung etwa gleich groß waren. Allerdings könnten sie auf Effekte von OA während der embryonalen Entwicklung hinweisen. Für die letzte Fragestellung meiner Arbeit habe ich wieder mit Juvenilen aus der dritten Gruppe (Wild) gearbeitet. I habe Metabolitprofile von Gewebe von Leber, weißem Muskel, Herz und Kieme aufgenommen und die Ergebnisse dieser Metabolitprofile mit den Ergebnissen aus den anderen Experimenten innerhalb des FITNESS Projektes verglichen: Es war möglich einige Ergebnisse dieser anderen Experimente im FITNESS Projekt mit den Ergebnissen auf Metabolomebene zur erklären. Erhöhte Protein- und Lipidsynthese im Lebergewebe, aber nicht im Muskelgewebe könnte erklären, warum die Juvenilen zwar schneller gewachsen sind, jedoch schlechtere Schwimmleistungen erbrachten. Erhöhte Glykolyse im Lebergewebe könnte einer der Hauptfaktoren für die erhöhte SMR in den warmakklimieren Wolfsbarschen gewesen sein. Als Schlussfolgerung meiner Arbeit kann ich sagen, dass ich dem Wissen über Fischphysiologie in Zeiten des Klimawandels einige wichtige Informationen hinzufügen konnte. Der Europäische Wolfbarsch wird während der Larvenentwicklung herausgefordert werden, aber wenn er als Juveniler in Kinderstuben mit ausreichend Nahrung ankommt, kann er von den höheren Temperaturen an dem nördlichen Ende seines Verbreitungsgebietes profitieren.