Temporal synaptic proteomic changes in the penumbra after ischemic stroke and investigation of Cystatin C as a possible stroke treatment

Abstract

Ischemic stroke is still a global challenge due to the limited treatment time window and the high rate of disability and mortality. Synaptic recovery is the prerequisite for neuronal functional restoration. We hypothesize that investigation of the inherent mechanism involved in synaptic remodeling could provide a new perspective for stroke treatment. Therefore, in this study, we have performed a temporal proteomic analysis of synaptosomes (i.e., synaptic terminals purified from brain) after stroke. Cystatin C (CysC), a cystatin protease known to inhibit cathepsins, and shown to be protective when exogenously administered after ischemic damage, was found significantly upregulated at 24h and 4d, but not at 7d after stroke. These results were validated by western blot analysis. To understand a possible mechanism whereby CysC could contribute to the synaptic rescue, we challenged neuronal cultures with an in vitro model of stroke and treated them with or without recombinant CysC (in a free form or inside extracellular vesicles (cEVs). We found that free CysC and cEVs protected the synaptic structures after ischemic damage. We then performed in vivo analysis by inoculating cEVs to stroke mice. We could not observe significant changes related ge to stroke volume, astrocyte and microglia activation, and neuronal viability, possibly due to the time-point chosen to observe the effects (24h). This study demonstrates that CysC administration might be a promising therapy against stroke but further investigation is needed for an effective therapeutic plan.

Der ischämische Schlaganfall stellt aufgrund des begrenzten Behandlungszeitfensters und der hohen Behinderungs- und Sterblichkeitsrate noch immer eine globale Herausforderung dar. Die Erholung der Synapsen ist die Voraussetzung für die Wiederherstellung der neuronalen Funktionen und das Überleben von Nervenzellen. Wir sind überzeugt, dass die Untersuchung der Mechanismen, die an der synaptischen Remodellierung beteiligt sind, eine neue Perspektive für die Schlaganfallbehandlung eröffnen könnte. Daher haben wir in dieser Studie eine zeitliche Proteomanalyse von Synaptosomen (das sind aus Hirngewebe isolierte synaptische Endigungen) nach dem Schlaganfall durchgeführt. Cystatin C (CysC), eine Cystatin-Protease, die bekanntermaßen Cathepsine hemmt und sich bei exogener Verabreichung nach ischämischer Schädigung als schützend erwiesen hat, war 24 Stunden und 4 Tage, nicht aber 7 Tage nach dem Schlaganfall signifikant hochreguliert. Diese Ergebnisse wurden durch eine Westernblot-Analyse bestätigt. Um einen möglichen Mechanismus zu verstehen, durch den CysC zur Rettung von Synapsen beitragen könnte, haben wir neuronale Kulturen mit einem In-vitro- Schlaganfallmodell behandelt und sie mit oder ohne rekombinantes CysC (in freier Form oder verpackt in extrazellulären Vesikeln (cEVs)) behandelt. Wir fanden heraus, dass freies CysC und cEVs die synaptischen Strukturen nach einer ischämischen Schädigung schützen. Anschließend führten wir eine In-vivo-Analyse durch, indem wir Mäusen nach Schlaganfall intrazerebral cEVs verabreichten. Wir konnten keine signifikanten Veränderungen in Bezug auf das Schlaganfallvolumen, die Astrozyten- und Mikrogliaaktivierung und die neuronale Lebensfähigkeit beobachten, was möglicherweise auf den für die Beobachtung der Auswirkungen gewählten Zeitpunkt (24 Stunden nach Schlaganfall) zurückzuführen ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verabreichung von CysC eine vielversprechende Therapie gegen Schlaganfall sein könnte, aber für einen wirksamen Therapieplan sind weitere Untersuchungen erforderlich.