Functional characterization of phospholipases during blood stage development of Plasmodium falciparum

Abstract

Malaria is one of the most important infectious diseases worldwide and represents a persistent socio-economic burden on mankind. The disease is caused by the unicellular Apicomplexan parasite Plasmodium whose asexual reproduction within red blood cells is responsible for all clinical symptoms of malaria. Among the human-infecting malaria parasite species, Plasmodium falciparum is the most lethal one.

For all cells, but especially for fast proliferating ones, such as the intraerythrocytic malaria parasite, a well-orchestrated lipid metabolism is essential. Enzymes involved in the respective metabolic pathways such as phospholipases have been shown to play crucial physiological roles and represent potential drug targets. The aims of this thesis are i) to functionally characterize the mitochondrial patatin-like phospholipase PNPLA2 (PF3D7_1358000) throughout intraerythrocytic parasite development and ii) to investigate the role of six additional phospholipases during gametocyte development and egress.

Towards the first aim, I showed that parasites lacking PNPLA2 displayed a severe growth phenotype and defects in their organellar ultrastructure. Moreover, PNPLA2-deficient parasites showed decreased mitochondrial respiration rates and had a lower mitochondrial membrane potential. The impaired organelle function rendered these mutant parasites hypersensitive to the anti-malarial drugs Proguanil and Atovaquone along with other inhibitors of the mitochondrial electron transport chain. However, the observed mitochondrial phenotypes were shown to be independent of ROS levels as well as ubiquinone recycling and thus pyrimidine biosynthesis. In line with the results from asexual stages, PNPLA2-KO parasites showed impaired gametocyte development with the majority of parasites only developing to stage III before displaying an aberrant morphology. Taken together, these data point towards an important function of PNPLA2 in mitochondrial physiology.

To study the effects of PNPLA2 deficiency on the lipid metabolism of the parasite, a cardiolipin-tailored lipidomic analysis of P. falciparum was executed. While this approach represents the first comprehensive investigation of cardiolipins of the malaria parasite, it also showed that upon loss of PNPLA2, the carbon chains of cardiolipins tend to be shorter and more saturated, implying a role of PNPLA2 in cardiolipin remodeling. We hypothesize that the modification of cardiolipin composition in PNPLA2-deficient parasites might be linked to the impairment of mitochondrial functions.

Towards the second aim, I explored the role of six additional phospholipases during gametocyte development by studying their localization and investigating whether their individual loss impairs gametocytogenesis or gamete egress. Interestingly, the dispensable PL38 phospholipase appeared to be localized to the rhoptries of asexual blood stages suggesting it might be involved in parasite egress or merozoite invasion.

To our surprise, five of the six phospholipases - LPL1 (PF3D7_1476700), LPL4 (PF3D7_0731800), PL38 (PF3D7_1412000), PL39 (PF3D7_1411900) and PARE (PF3D7_0709700) - were shown to be dispensable for gametocyte development and gamete egress. However, PNPLA3 (PF3D7_0924000)-deficient parasites showed a significant delay in efficient exflagellation of male gametocytes indicating an important, albeit not essential, role of PNPLA3 in male gametogenesis. Taken together, these results illustrate a high level of redundancy of parasite phospholipases during gametocytogenesis under in vitro conditions and indicate a complex interplay of the individual members of this enzyme family.

Malaria ist eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten der Welt. Etwa die Hälfte der Weltbevölkerung ist dem Risiko einer Infektion ausgesetzt, was Malaria bis heute zu einer enormen sozio-ökonomischen Belastung für die Menschheit macht. Verursacht wird die Krankheit durch den einzelligen, eukaryotischen Parasiten Plasmodium, dessen ungeschlechtliche Vermehrung in den roten Blutkörperchen alle klinischen Symptome der Malaria verursacht. Unter den humaninfektiösen Malariaparasiten ist Plasmodium falciparum die tödlichste Art.

Lipide, insbesondere Phospholipide, sind essentielle Bestandteile aller lebender Zellen, die als Strukturelemente, Energiespeicher und Signalmoleküle dienen. Aufgrund dieser zentralen Bedeutung ist die differenzielle Regulation des Lipidmetabolismus von besonderer Bedeutung. Das trifft insbesondere für solche Zellen zu, die sich sehr schnell vermehren, wie beispielsweise Malariaparasiten in unseren roten Blutkörperchen. Die Modifikation und Regulation von Phospholipiden wird unter anderem von Enzymen wie Phospholipasen geleistet, die Lipide in Fettsäuren und weitere lipophile Moleküle hydrolysieren, um sie so verschiedensten Stoffwechselwegen zur Verfügung zu stellen. Durch ihre zentrale physiologische Rolle stellen diese Enzyme potenzielle Angriffspunkte für Medikamente dar. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die funktionelle Charakterisierung ausgewählter Phospholipasen des Malariaparasiten P. falciparum. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Funktion der Patatin-ähnlichen Phospholipase PNPLA2 (PF3D7_1358000) während der gesamten intraerythrozytären Entwicklung des Parasiten eingehend untersucht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle von sechs weiteren Phospholipasen während der zweiwöchigen Gametozytenentwicklung und Gametenfreisetzung charakterisiert.

Im Hinblick auf das erste Ziel konnte zunächst gezeigt werden, dass PNPLA2 im Mitochondrium des Parasiten lokalisiert. Mit Hilfe von verschiedenen Methoden der reversen Genetik wurde dann gezeigt, dass PNPLA2-Defizienz zu einem schweren Wachstumsphänotypen sowie zu Defekten in der zellulären Ultrastruktur führt. Nachfolgende Untersuchungen zeigten, dass PNPLA2-defiziente Parasiten eine verminderte mitochondriale Respiration und ein niedrigeres mitochondriales Membranpotenzial aufwiesen. Diese Beeinträchtigung der Mitochondrienfunktion führte zudem zu einer Überempfindlichkeit der Parasiten gegenüber den Malariamedikamenten Proguanil und Atovaquone sowie anderen Inhibitoren der Atmungskette. Die beobachteten Defekte waren dabei unabhängig vom Level an reaktiven Sauerstoffspezies sowie vom Ubiquinon-Zyklus und damit von der Pyrimidin-Biosynthese. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus dem asexuellen Stadium zeigten PNPLA2-defiziente Parasiten starke Defekte in der Gametozytenentwicklung: Die Mehrheit der Parasiten entwickelte sich lediglich bis zum Stadium III, bevor sie eine anomale Morphologie aufwiesen. Zusammengenommen deuten diese Daten auf eine wichtige Funktion von PNPLA2 in der mitochondrialen Physiologie hin.

Um die Auswirkungen des Verlusts von PNPLA2 auf den Lipidstoffwechsel des Parasiten zu untersuchen, wurde anschließend das Lipidom von P. falciparum mit einem speziellen Fokus auf Cardiolipinen untersucht. Diese erste, umfassende Cardiolipin-Analyse des Malariaparasiten zeigte, dass die Kohlenstoffketten der Cardiolipine nach dem Verlust von PNPLA2 tendenziell kürzer und stärker gesättigt sind, was auf eine Rolle von PNPLA2 beim Umbau der Cardiolipine hindeutet. Die veränderte Zusammensetzung der Cardiolipine in PNPLA2-defizienten Parasiten könnte dabei mit der Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktionen zusammenhängen.

Im Hinblick auf das zweite Ziel wurde die Rolle von weiteren sechs weiteren Phospholipasen während der Gametozytenreifung und der Freisetzung der sexuell differenzierten Gameten untersucht. Zunächst wurde die Expression und Lokalisation der entsprechenden Enzyme experimentell ermittelt, bevor die phänotypische Auswirkung von individuellen Gen-Knockouts der Phospholipasen auf Gametozytogenese und Gametogenese untersucht wurde. Interessanterweise wurde hierbei die Phospholipase PL38 als ein Rhoptrien-Protein identifiziert, was auf eine Rolle dieser Lipase für die Zell-Zell-Interaktion während des Austritts aus der Wirtszelle oder der Merozoiteninvasion nahelegt.

Die detaillierte Analyse der Phospholipase-Knockout-Linien erwies überraschenderweise, dass fünf der sechs Phospholipasen - LPL1 (PF3D7_1476700), LPL4 (PF3D7_0731800), PL38 (PF3D7_1412000), PL39 (PF3D7_1411900) und PARE (PF3D7_0709700) - entbehrlich für die Gametozytogenese und den Gametenaustritt sind. Lediglich PNPLA3 (PF3D7_0924000)-defiziente Parasiten zeigten eine deutlich verzögerte Exflagellation, was auf eine Rolle von PNPLA3 bei der männlichen Gametogenese hindeutet. Zusammengenommen konnte gezeigt werden, dass Phospholipasen in der Gametozytenentwicklung unter In-vitro-Bedingungen ein hohes Maß an Redundanz aufweisen, was ein komplexes Zusammenspiel der Enzyme dieser Familie vermuten lässt.