The Role of P2X4 and P2X7 on the Formation of Ca2+ Microdomains in T cells

Abstract

The adaptive immune response is initiated by the activation of T cells. Following this activation, calcium (Ca2+) signals translate an external stimulus into intracellular responses. These signals are characterized by initial, spatiotemporally restricted Ca2+ microdomains in T cells. T cell receptor (TCR) stimulation triggers the formation of second messengers like D-myo-inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3), cyclic adenosine diphosphate ribose (cADPR) or nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP). The recently identified hematological and neurological expressed 1-like protein (HN1L)/ Jupiter microtubule-associated homolog 2 (JPT2) orchestrates the NAADP activating the ryanodine receptors (RYR) in the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). The RYR releases Ca2+ from the ER. Thus, the Ca2+ release-activated channel (CRAC) ORAI1 initiates store-operated Ca2+ entry (SOCE) through the plasma membrane (PM). These spatiotemporally restricted Ca2+ signals influence downstream effects like the translocation of the nuclear factor of activated T cells (NFAT), which further stimulate the production of cytokines and cell proliferation. The visualization of highly dynamic Ca2+ microdomain signals is challenging due to low signal-to-noise ratios (SNR). Computational image restoration is one approach to improve the quality of low SNR images. Hence, in this study, a deconvolution algorithm emphasizing the characteristics of low SNR fluorescence images was extended for image sequences to increase not only spatial resolution but also temporal resolution (2.1; Woelk et al., 2021). Common algorithms were adjusted for single-frame images but also used on image sequences regardless of the temporal relationships of a multi-frame series. The extended algorithm now emphasizes both, the spatial and temporal features of an image sequence. Moreover, it was tested on Ca2+ microdomain sequences measured with different setups and compared with common algorithms. Finally, the comparisons highlight the improvements of using our extended algorithm on Ca2+ microdomain visualization. Additionally, in this thesis, for the first time, the purinergic ligand-gated cation channels (P2X) P2X4 and P2X7 were demonstrated to influence the formation of the local, highly dynamic Ca2+ microdomains before and after T cell stimulation (2.2; Brock et al., 2022). Thus, using a high-resolution live-cell imaging technique Ca2+ microdomains were shown to be significantly reduced in P2rx4-/- and P2rx7-/- T cells and cells incubated with pharmacological inhibitors or inhibiting nanobodies for these channels after TCR/CD3 stimulation. Removal of the extracellular adenosine 5´triphosphate (ATP), which activates the P2X channels, or inhibition of the ATP releasing channel pannexin-1 (PANX1), significantly decreased the number of Ca2+ microdomains after T cell activation. Interestingly, P2X4 and PANX1 but not P2X7 influence the formation of TCR/CD3-independent Ca2+ microdomains, indicating different time periods of channel activity. These results and further colocalization analysis, global Ca2+ imaging and expression or proliferation analysis reveal functional differences between P2X4 and P2X7 activity. In summary, this thesis established a computational approach to significantly improve the resolution of dynamic Ca2+ motions in fluorescence image sequences with very low SNRs. Furthermore, this work highlights the previously unexpected influence of the purinergic channels P2X4, P2X7 and the ATP-releasing channel PANX1 on the formation of Ca2+ microdomains, the fine-tuning of which may direct the adaptive immune response.

Die adaptive Immunantwort wird initiiert durch die Aktivierung von T Zellen. In Folge dieser Aktivierung wird durch Calcium (Ca2+) Signale ein externer Stimulus in eine intrazelluläre Antwort übersetzt. Diese Ca2+ Signale sind in T Zellen durch sogenannte initiale, räumlich und zeitlich begrenzte Ca2+ Mikrodomänen charakterisiert. Durch die Stimulation des T Zellrezeptors (TCR) werden sekundäre Botenstoffe wie D-myo-Inositol 1,4,5-Trisphosphat (IP3), zyklische Adenosindiphosphat Ribose (cADPR) oder Nikotinsäure-adenindinucleotidphosphat (NAADP) gebildet. Das kürzlich identifizierte Protein „hematological and neurological expressed 1-like protein“ (HN1L) / “Jupiter microtubule-associated homolog 2” (JPT2) interagiert mit NAADP und aktiviert so Ryanodin Rezeptoren (RYR) in der Membran des Endoplasmatischem Retikulums (ER). Ca2+ wird durch den RYR aus dem ER freigesetzt. Der durch Ca2+-Freisetzung aktivierte Kanal (CRAC) ORAI1 initiiert im Folgenden den „store-operated Ca2+ entry“ (SOCE), dies führt zu einem Ca2+ Einstrom über die Plasmamembran (PM). Die lokal und zeitlich begrenzten Ca2+ Signale beeinflussen nachgeschaltete Effekte wie die Translokation des Transkriptionsfaktors „nuclear factor of activated T cells” (NFAT), der wiederum die Produktion von Zytokinen und die Zellproliferation stimuliert. Die Visualisierung der hochdynamischen Ca2+ Mikrodomänen ist aufgrund des geringen Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) eine Herausforderung. Computergestützte Bild-wiederherstellung ist ein Ansatz zur Verbesserung der Qualität von Bildern mit niedrigem SNR. Daher wurde in dieser Studie ein Dekonvolutionsalgorithmus, der die Merkmale von Fluoreszenzbildern mit niedrigem SNR berücksichtigt, für Bildsequenzen erweitert, um nicht nur die räumliche, sondern auch die zeitliche Auflösung zu verbessern (2.1; Woelk et al., 2021). Die Algorithmen, die im Allgemeinen verwendet werden, sind oft auf Einzelbilder angepasst. Allerdings werden sie auch auf Bildsequenzen Bild-für-Bild angewendet, ohne die zeitlichen Beziehungen einer Mehrbildserie zu berücksichtigen. Der erweiterte Algorithmus in dieser Doktorarbeit geht nun sowohl auf die räumlichen als auch die zeitlichen Merkmale einer Bildsequenz ein. Darüber hinaus wurde er an Aufnahmen von Ca2+ Mikrodomänen getestet, die unter verschiedenen Bedingungen aufgenommen wurden, und mit herkömmlichen Algorithmen verglichen. Die Vergleiche zeigen eine deutliche Verbesserung, die unser erweiterter Algorithmus bei der Visualisierung von Ca2+ Mikrodomänen mit sich bringt. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt, dass die purinergen ligandengesteuerten Kationenkanäle (P2X) P2X4 und P2X7 die Bildung der lokalen, hochdynamischen Ca2+ Mikrodomänen vor und nach der Stimulation von T Zellen beeinflussen (2.2; Brock et al., 2022). So konnte mit Hilfe eines hochauflösenden „Live-Cell-Imaging“-Verfahrens gezeigt werden, dass Ca2+ Mikrodomänen in P2rx4-/- und P2rx7-/- T Zellen sowie in Zellen, die mit pharmakologischen Inhibitoren oder hemmenden Nanokörpern für diese Kanäle inkubiert wurden, nach einer TCR/CD3-Stimulation signifikant reduziert sind. Die Entfernung des extrazellulären Adenosintriphosphats (ATP), das die P2X-Kanäle aktiviert, oder die Hemmung des ATP-freisetzenden Kanals Pannexin-1 (PANX1) verringerte die Anzahl der Ca2+ Mikrodomänen nach der T Zell Aktivierung signifikant. Interessanterweise beeinflussen P2X4 und PANX1, nicht aber P2X7, die Bildung von TCR/CD3-unabhängigen Ca2+ Mikrodomänen, was auf unterschiedliche Zeitpunkte der P2X-Kanalaktivität hinweist. Diese Ergebnisse sowie Ko-Lokalisationsanalysen, globale Ca2+ Messungen und Expressions- bzw. Proliferationsanalysen weisen auf funktionelle Unterschiede zwischen P2X4 und P2X7 hin. Zusammenfassend zeigt diese Doktorarbeit einen computergestützten Ansatz auf, um die Auflösung von dynamischen Ca2+ Bewegungen in Fluoreszenzbildsequenzen mit sehr geringen SNRs deutlich zu verbessern. Darüber hinaus hebt diese Arbeit den bisher unerwarteten Einfluss der purinergen Kanäle P2X4, P2X7 und des ATP-freisetzenden Kanals PANX1 auf die Bildung von Ca2+ Mikrodomänen hervor, deren präzise geregelten Dynamiken die adaptive Immunantwort lenken könnten.