Titel: Untersuchungen zur Regulation des Transkriptionsfaktors Grainyhead-like 2 (GRHL2) in humanen Mammakarzinomzelllinien
Sprache: Deutsch
Autor*in: Neu, Johanna
Schlagwörter: GRHL2; Mammakarzinom; posttranslationale Regulation; transkriptionelle Regulation
Erscheinungsdatum: 2022
Tag der mündlichen Prüfung: 2022-07-15
Zusammenfassung: 
Der zur Grainyhead-Familie gehörende Transkriptionsfaktor Grainyhead-like 2 (GRHL2) spielt eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung und bei der Morphogenese und Differenzierung von Epithelzellen. In jüngster Zeit konnte darüber hinaus in zahlreichen Studien gezeigt werden, dass GRHL2 auch eine große Bedeutung bei der Entstehung und Progression unterschiedlichster Tumoren besitzt, indem es als potenter Suppressor der Epithelial-Mesenchymalen Transition (EMT) die Metastasierung von Tumoren unterdrücken, aber auch als Onkogen das Tumorwachstum fördern kann. Ziel dieser Arbeit war es, neue Mechanismen der Regulation der Aktivität oder Expression des GRHL2-Transkriptionsfaktors in Tumorzellen zu identifizieren, um dadurch ein besseres Verständnis der Rolle von GRHL2 bei der Entstehung und Progression des humanen Mammakarzinoms zu erlangen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei neuartige, sehr unterschiedliche Mechanismen der Regulation von GRHL2 in Tumorzellen identifiziert werden:

1.) Phosphorylierungs-abhängige Regulation der Stabilität des GRHL2-Proteins
• Durch die Identifizierung von drei Phosphorylierungsstellen innerhalb des GRHL2-Proteins (S210, T211, S214) konnte erstmals der Nachweis erbracht werden, dass es sich bei dem Transkriptionsfaktor GRHL2 um ein nukleäres Phosphoprotein handelt.
• Es gelang die Herstellung und Charakterisierung Phospho-spezifischer Antikörper gegen alle drei Phosphorylierungsstellen von GRHL2, die als wertvolle Forschungsreagenzien für weitere Untersuchungen zur Verfügung stehen.
• Es konnte gezeigt werden, dass alle drei Phosphorylierungsstellen innerhalb einer PEST-Sequenz (AS S210 - F220), die Teil eines ausgedehnten Degrons innerhalb des GRHL2-Proteins ist, lokalisiert sind.
• Umfassende Mutationsanalysen und der Einsatz des Proteinbiosynthese-Inhibitors Cycloheximid (CHX) belegten, dass die Phosphorylierungen innerhalb der PEST-Sequenz die Stabilität von GRHL2 unterschiedlich beeinflussen. Eine Phosphorylierung von GRHL2 an den Resten S210 und T211 induzierte eine erhöhte Halbwertszeit und damit Stabilität des GRHL2-Proteins, wohingegen die Phosphorylierung an S214 eher destabilisierend wirkte.
• Mit Hilfe aufwendiger Screening-Verfahren und durch den gezielten Einsatz von Kinase-Inhibitoren, konnten erste Kandidaten-Kinasen für die Phosphorylierung an den drei Resten S210, T211, S214 des GRHL2-Proteins identifiziert werden.
Obwohl Kinasen und Signalwege, die zur Phosphorylierung von GRHL2 innerhalb des eine PEST-Sequenz enthaltenen Degrons noch nicht eindeutig identifiziert werden konnten, belegen die Resultate dieser Arbeit die Existenz eines neuartigen Regulationsmechanismus‘, der auf der posttranslationalen Regulation der GRHL2-Proteinstabilität in Tumorzellen beruht.

2.) Transkriptionelle Regulation der GRHL2-Expression in Tumorzellen
• Eine Stimulation mit dem Phorbolester Phorbol-2-myristat-3-acetat (PMA), einem potenten Aktivator der Protein-Kinase C (PKC), induzierte eine signifikante Reduktion der GRHL2-Expression in einer Reihe von Mammakarzinomzelllinien, die unterschiedliche Subtypen dieser Tumorentität repräsentieren.
• Die Herabregulation der GRHL2-Expression erwies sich zeit- und konzentrationsabhängig.
• Die vergleichende Analyse der GRHL2 mRNA- und Protein-Expression in PMA-stimulierten Zellen ergab, dass die Herabregulation der GRHL2-Expression auf der transkriptionellen Ebene erfolgt.
• Durch den gezielten Einsatz unterschiedlicher Inhibitoren und einen siRNA-vermittelten Knockdown verschiedener PKC-Isoformen, konnte PKCδ als diejenige Kinase identifiziert werden, die die Herabregulation von GRHL2 in Mammakarzinomzellen induziert.
• Durch bioinformatische Analysen konnte eine kleine Anzahl von Transkriptionsfaktoren (z.B. SP1) identifiziert werden, die möglicherweise die PKCδ-induzierte Suppression der GRHL2-Expression in Mammakarzinomzellen vermitteln könnte.

Obwohl es noch einiger weiterführender Untersuchungen bedarf, kann zusammenfassend festgestellt werden, dass in dieser Arbeit zwei neuartige, mechanistisch sehr unterschiedliche Regulationsmechanismen identifiziert werden konnten, die die Expression und Aktivität des Transkriptionsfaktors GRHL2 in Mammakarzinomzellen modulieren. Mit der Identifizierung und teilweisen Aufklärung dieser neuen regulatorischen Prinzipien konnte ein wesentlicher Beitrag zum besseren Verständnis der Rolle des Transkriptionsfaktors GRHL2 bei der Entstehung und Progression des Mammakarzinoms geleistet werden.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/9758
URN: urn:nbn:de:gbv:18-ediss-102200
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Pantel, Klaus
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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