Analyse der Bindungseigenschaften zwischen P. falciparum infizierten Erythrozyten und verschiedenen Endothelrezeptoren

Abstract

Mit P. falciparum infizierte Erythrozyten (iEs) binden an Endothelrezeptoren (ERs). So entgehen sie ihrer Beseitigung durch die Milz und können dadurch im menschlichen Wirt überleben (Andrews, 2005; Milner, 2015; Newbold, 1999; Smith, 2014; Smith, 2000). Je nach Ort, wo diese Zytoadhäsion stattfindet, kann sie für den menschlichen Wert schwerwiegende Folgen haben (Hviid, 2015; Phillips, 2017; Rowe, 2009). Die Zytoadhäsion von iEs resultiert vor allem aus Wechselwirkungen zwischen Mitgliedern der P. falciparum erythrocyte membrane proteine 1 (PfEMP1) -Familie und verschiedenen ERs. Die Untersuchung der molekularen Grundlagen des iE-Rezeptor-Interaktionsmechanismus ist essentiell um die Pathogenese dieses tödlichen Parasiten im Ganzen zu verstehen. Um das Bild der verschiedenen Rezeptor-Ligand-Partner zu vervollständigen, wurde in dieser Arbeit der Bindungsphänotyp unterschiedlicher PfEMP1s und ERs mit Hilfe verschiedener Bindungsexperimente charakterisiert. Es war erstmals möglich IT4-Transfektanten zu untersuchen, welche ausschließlich ein spezielles PfEMP1-Protein auf der Erythrozyten Oberfläche präsentierten und dieses aufgrund eines Selektionsdrucks nicht durch Gen-switching ändern konnten. Die untersuchten Transfektanten (IT4-SLIvar01; -var02, -var03, -var08 und –var16) wurden mithilfe der selection-linked integration (SLI)-Methode hergestellt (Birnbaum, 2017). In Kombination mit den, in allen Experimenten verwendeten, transgenen CHO-745-Zellen, die die jeweiligen humanen ERs auf ihrer Oberfläche präsentieren, wurde es so möglich, Interaktionen gegenüber getesteten Rezeptoren klar einem bestimmten PfEMP1-Protein zuzuordnen und ermöglichten die strukturierte Untersuchung der Bindungsunterschiede der verschiedenen PfEMP1-Proteine. So zeigten z. B. statische Bindungsassays mit IT4-SLI-var01 und var16 infizierten Erythrozyten (iEs), dass die Transfektanten, die literaturbekannte Bindung gegenüber CD36 und ICAM-1 ausbildeten und die Rezeptoren TNFR2, VCAM-1 und P-Selektin (im Fall von IT4SLI-var01 auch CD9) zusätzliche Bindungspartner darstellen. In Bindungsassays unter Flussbedingungen konnte dann der jeweilige Bindungsphänotyp des IT4-SLIvar01 Transfektanten gegenüber CD36 und ICAM-1 bestimmt und mittels single cell force spectroscopy (SCFS) diese Bindungen auch auf molekularer Ebene genauer verglichen werden. Um noch einen Schritt weiter zu gehen und zu untersuchen, ob das beobachtete Bindungsverhalten einzelnen Domänen zugeordnet werden kann, wurden die einzelnen Domänen der entsprechenden var-Gene zusätzlich rekombinant exprimiert und über einen Histidin-tag an Nickel-beads gebunden. Mit diesen beads wurden dann ebenfalls statische Bindungsassays mit verschiedenen humanen Rezeptoren durchgeführt. Die Ergebnisse der Ni-bead Assays zeigten unter anderem, dass DBLγ10-Domänen eine Rolle bei der Bindung an verschiedene humane Rezeptoren spielen könnten und stellen außerdem eine relevante Rolle der CIDRα1.4-Domäne von IT4_var07 bei der Bindung an EPCR in Frage. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass die Kombination von Experimenten mit IT4-SLI-var-Transfektanten und einzelnen an Ni-beads gebundenen PfEMP1-Domänen eine sehr gute Möglichkeit darstellt, um das Bild der verschiedenen Rezeptor-Ligand-Partner zu vervollständigen.