Characterization of genetically modified mice carrying pathogenic mutations in the Notch2 or Wnt1 gene

Abstract

Bone is a highly dynamic tissue that constantly undergoes a physiologically relevant remodeling process mediated by coordinated activities of bone-forming osteoblasts and bone-resorbing osteoclasts. Imbalanced activities of these two cell types can cause a variety of skeletal disorders among which osteoporosis shows the highest prevalence and socio- economic impact. On a cellular level, osteoporosis is caused by a relative increase of bone resorption over bone formation resulting in decreased bone mineral density and increased skeletal fracture risk. Since underlying mechanisms causing this pathology are highly variable, understanding the mode of action of osteoblasts and osteoclasts is of high importance. This also includes the identification of regulatory molecules and signaling pathways controlling the function of these two cell types. Notch signaling was long known for its impact in neuronal development, where it controls intracellular communication. Only recently, its role in bone remodeling was uncovered by the identification of a pathogenic NOTCH2 mutation in individuals with Hajdu-Cheney syndrome (HCS). More specifically, HCS is a rare autosomal dominant disorder primarily affecting the skeleton, since patients display early-onset osteoporosis, acro-osteolyses, short stature, and coarse facies. All identified NOTCH2 mutations causing HCS result in the absence of the C-terminal PEST-domain, which is required for proteasomal degradation of the protein. Consequently, these mutations are predicted to result in a prolonged NOTCH2 signal. To understand the role of NOTCH2 in bone remodeling, a mouse model carrying a pathogenic 6272delT mutation in Notch2, causing HCS in humans, was generated and analyzed. Studies of the skeleton of these mice revealed generalized osteopenia caused by a high bone turnover, i.e. osteoblast and osteoclast indices were both increased. After ruling out cell-autonomous gain-of-functions in either osteoblasts or osteoclasts, RNA sequencing revealed increased expression of the pro-osteoclastogenic genes Tnfsf11 and Il6 in bone marrow cells obtained from Notch2+/HCS mice cultured under osteogenic conditions. Furthermore, anti-resorptive alendronate treatment fully corrected the high bone turnover phenotype observed in Notch2+/HCS mice, which is potentially explained by impaired release of osteoclast-derived factors coupling bone formation to bone resorption. Analyses of two osteoclast-derived coupling factors, S1P and Wnt1, did however not reveal any impact on the bone phenotype of Notch2+/HCS mice. In the context of this study, it was however important that analysis of mice lacking Wnt1 either in the osteoclast or osteoblast lineage revealed remarkable results. In fact, while Wnt1 inactivation in osteoclasts did not affect bone remodeling, all mice with Wnt1 inactivation in osteoblasts displayed low bone mass and various skeletal fractures. Since WNT1 mutations were previously identified in patients with osteogenesis imperfecta type XV (OI type XV), the final part of this thesis aimed at generating and analyzing a mouse model of this disorder, which was achieved by introducing a pathogenic mutation (G177C) into the murine Wnt1 gene. The resulting Wnt1G177C/G177C mice exhibited a moderate reduction of trabecular and cortical bone mass, explained by reduced osteoblast activity. Most importantly, the majority of 24 weeks old Wnt1G177C/G177C mice displayed skeletal fractures in various locations, suggesting that Wnt1 primarily controls bone matrix quality. This newly developed mouse model of OI type XV was further utilized to demonstrate that the Wnt1G177C/G177C mutation does not interfere with the osteoanabolic influence of parathyroid hormone 1-34 (PTH (1-34)) treatment, both in vitro and in vivo. Taken together, the results of this thesis demonstrate that the low bone mass phenotypes of Notch2+/HCS and Wnt1G177C/G177C mice are explained by different underlying mechanisms. Whereas the Notch2+/HCS mutation favors pro-osteoclastogenic gene expression, triggering a high bone turnover pathology, the Wnt1G177C/G177C mutation specifically affects bone formation and bone matrix quality. In both cases, the mouse models were additionally used to demonstrate possible treatment options, i.e. bisphosphonate administration for HCS and daily PTH(1-34) injections for OI type XV.

Knochen ist ein hochdynamisches Gewebe, welches einem stetigen Umbau unterliegt. Dieser physiologisch relevante Prozess wird von knochenformenden Osteoblasten und knochenresorbierenden Osteoklasten vermittelt. Gerät jedoch die Aktivität dieser beiden Zelltypen aus dem Gleichgewicht, können erhebliche Störungen des Skelettsystems entstehen. Unter diesen Störungen stellt Osteoporose die am häufigsten vorkommende skelettale Krankheit mit der höchsten sozial-ökonomischen Auswirkung dar. Auf zellulärer Ebene wird Osteoporose durch eine erhöhte Knochenresorption gegenüber der Knochenformation verursacht. Dies hat eine verringerte Knochenmasse und ein erhöhtes Frakturrisiko zur Folge. Da die Auslöser dieser Störung unterschiedlichsten Ursprungs sein können, ist die Erforschung von Funktionsweisen sowie die Identifizierung regulatorischer Moleküle und Signalwege, die die Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten beeinflussen, von enormer Bedeutung. Notch-Signale waren lange für ihren Einfluss auf die neuronale Entwicklung bekannt, bei der sie die intrazelluläre Kommunikation kontrollieren. Erst kürzlich wurde ihre Rolle im Knochenmetabolismus durch die Identifizierung von Mutationen im NOTCH2-Gen, welche zum Hajdu-Cheney Syndrom (HCS) führen, aufgedeckt. Hierbei handelt es sich um eine seltene autosomal-dominante Erkrankung, die sich primär durch früh einsetzende Osteoporose, Acro-Osteolysen, Minderwuchs und grobe Gesichtszüge auszeichnet. Alle bereits identifizierten HCS-assoziierten NOTCH2-Mutationen führen zum Fehlen der C-terminalen PEST-Domäne, welche für den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Daraus resultiert ein anhaltendes NOTCH2-Signal im Patienten. Um die Rolle von NOTCH2 während des Umbaus von Knochen genauer zu verstehen, wurde ein Mausmodell generiert und analysiert, welches eine pathogene 6272delT Mutation im Notch2-Gen trägt, die im Menschen zu HCS führt. Skelettale Untersuchungen ergaben einen erhöhten Knochenumsatz, der durch eine erhöhte Osteoblasten- und Osteoklastenanzahl verursacht wird und in einer Osteopenie resultiert. Nachdem zellautonome Störungen in beiden Zelltypen ausgeschlossen werden konnten, wurden osteogen-kultivierte Knochenmarkszellen aus Notch2+/HCS-Mäusen mittels RNA-Sequenzierung analysiert und eine erhöhte Expression von Tnfsf11 und Il6 festgestellt. Diese beiden Faktoren sind für die Unterstützung der Osteoklastogenese bekannt. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine anti-resorptive Behandlung von Notch2+/HCS-Mäusen mit Alendronat den erhöhten Knochenumsatz in Notch2+/HCS-Mäusen korrigiert. Diese Korrektur wird vermutlich durch eine verminderte Freisetzung von osteoklastären Faktoren, die Knochenformation und Knochenresorption miteinander koppeln, vermittelt. Allerdings wiesen Untersuchungen der Kopplungsfaktoren S1P und Wnt1 keinen Einfluss in Bezug auf den Knochenphänotypen von Notch2+/HCS-Mäusen auf. In Zusammenhang mit den eben beschriebenen Untersuchungen lieferte die Analyse von Mäusen mit einem inaktivierten Wnt1-Gen im Osteoklasten bzw. im Osteoblasten bemerkenswerte Ergebnisse. Während eine Wnt1-Inaktivierung im Osteoklasten den Umbau des Knochens nicht beeinflusste, konnten in allen Mäusen, die eine Wnt1-Inaktivierung im Osteoblasten trugen, eine verringerte Knochenmasse und diverse Frakturen nachgewiesen werden. Da im Menschen kürzlich Mutationen im WNT1-Gen identifiziert wurden, die zu Osteogenesis Imperfecta Typ XV (OI Typ XV) führen, beschäftigt sich der letzte Teil dieser Arbeit mit der Generierung und Untersuchung eines Mausmodells, welches eine mit OI Typ XV-assoziierte Mutation (G177C) im Wnt1-Gen trägt. Resultierende Wnt1G177C/G177C-Mäuse wiesen eine moderat verminderte trabekuläre und kortikale Knochenmasse auf, die durch eine verminderte Aktivität von Osteoblasten erklärt werden konnte. Zusätzlich wiesen diese Mäuse im Alter von 24 Wochen skelettale Frakturen in verschiedenen Regionen auf, wodurch die Rolle von Wnt1 in Bezug auf die Knochenqualität verdeutlicht wurde. Des Weiteren konnte mit diesem OI Typ XV-Mausmodell gezeigt werden, dass die Mutation sowohl in vitro als auch in vivo keinen Einfluss auf die osteoanabole Wirkung des Parathormonfragments 1-34 (PTH(1-34)) hat. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass der verringerten Knochenmasse in Notch2+/HCS- und Wnt1G177C/G177C-Mäusen unterschiedliche Mechanismen zugrunde liegen. Während Osteoblasten von Mäusen, die die Notch2+/HCS-Mutation tragen, vermehrt Gene exprimieren, die die Osteoklastogenese unterstützen und dadurch den erhöhten Knochenumsatz veranlassen, führt die Wnt1G177C/G177C-Mutation zu einer beeinträchtigten Knochenformation und Knochenqualität. In beiden Fällen wurden die Mausmodelle zusätzlich verwendet, um potenzielle Behandlungsmöglichkeiten, wie beispielsweise eine Bisphosphonatgabe für HCS-Patienten und eine tägliche PTH(1-34)-Injektion für Patienten mit OI typ XV, aufzuzeigen.