The influence of SUMOylation on the adenoviral early region 4 protein Orf6/7

Abstract

The human adenovirus type 5 (HAdV-5) early region 1B 55-kDa product (E1B-55K) is a multifunctional 496 amino acid polypeptide that exploits the host SUMO conjugation system to promote efficient viral replication. A comprehensive proteomic analysis in wild type and E1B mutant virus-infected cells was performed to reveal the effect of E1B-55K on the SUMO proteome of the host cell. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) followed by Ni-NTA pulldown experiments and mass spectrometry detected 272 SUMOylated cellular proteins that were exclusively during wild type infection. Of these proteins, the abundance of 78 was increased by a factor of two or more. Besides cellular proteins, also 20 viral proteins were found to be SUMOylated whereat three of them occurred exclusively during wild type infection. One of them was the 19.8 kDa protein encoded in the early region 4 open reading frame 6/7 (E4orf6/7). This E4 protein is required for the initiation of viral DNA replication and cooperates with the early region protein 1A (E1A), to drive post-mitotic resting cells into S-phase by activating E2F responsive promoters. In contrast to E1A, E4orf6/7 dimerizes E2F transcription factors thereby increasing the activity of E2F target promoters. Previous studies have shown that dimerization of E2F transcription factors by E4orf6/7 is, in particular, important for the transactivation of the E2F-1 promoter, and the re localization of E2F-4 from the cytoplasm into the nucleus. In order to elucidate the functional consequences of E4orf6/7 SUMOylation on known E4orf6/7 function(s), we generated several virus- and plasmid-encoded E4orf6/7 mutants leading to the substitution of lysine by an arginine, within the protein. Using these E4orf6/7 variants we confirmed SUMOylation of E4orf6/7 in plasmid-transfected cells and identified, for the first time, lysine 68 as the site of SUMO conjugation. Functional studies using transient reporter assays showed that the arginine substitution at lysine 68 (K68R) has no significant effect on the viral E2A or the cellular E2F 1 promoter. Furthermore, the intracellular localization and abundance of E4orf6/7 as well as the interaction with E4orf6/7 targets was not impaired. Intriguingly, the stability of the E4orf6/7 K68R mutant was substantially reduced, accompanied by a significant increase in the cellular FAM111B mRNA abundance, a gene which is also controlled by E2F binding sites. These results not only indicate that SUMOylation regulates the stability of the E4 protein during the course of a productive infection. But also they give rise to the assumption that E4orf6/7 either inhibits the FAM111B and may be other cellular promoters or specifically stabilizes mRNAs in a SUMOylation dependent manner.

Adenoviren sind dafür bekannt posttranslationale Modifikationen zu nutzen, um eine effiziente Virusreplikation zu ermöglichen. Eine besondere Rolle spielen hierbei so genannte SUMOlierungen, welche unter anderem die Aktivität des frühen adenoviralen Proteins E1B 55K regulieren. Weiterhin wurde gezeigt, dass E1B 55K die SUMOlierung des pro-apoptotischen Proteins p53 induzieren kann. Daher wurden Zellen mit einem Wild-Typ Adenovirus oder einer E1B 55K deletierten Mutante infiziert und anschließend das SUMO-Proteom analysiert, um weitere E1B abhängig SUMOlierte Proteine zu detektieren. Hierfür wurden zunächst Proteine durch Isotopen markiert. Im Anschluss wurden SUMOlierte Proteine über Affinitätschromatographie aufgereinigt und mit einem Massenspektrometer analysiert. Insgesamt wurden in der Wild-Typ Infektion 272 SUMOlierte zelluläre Proteine detektiert, wovon 78 Proteine eine mindestens zweifach höhere SUMOlierung ausschließlich in der Wild-Typ Infektion aufwiesen. Ebenso wurden 20 SUMOlierte virale Proteine gefunden, von denen drei nur in der Wild-Typ Infektion detektiert werden konnten. Eines davon ist das, in der E4 Region kodierte, Protein Orf6/7 (E4orf6/7). Dieses 19.8 kDa große Protein ist zusammen mit dem viralen Protein E1A maßgeblich für die Aktivierung von E2F Promotoren verantwortlich, um post-mitotisch ruhende Zellen in die S Phase zu überführen. Im Gegensatz zu E1A verfügt E4orf6/7 über die Fähigkeit zwei E2F Transkriptionsfaktoren zu binden und dadurch eine kooperative Bindung zu Promotoren mit zwei invertierten E2F Bindestellen zu ermöglichen. Vergangene Studien legen nahe, dass besonders die Regulierung des viralen E2A als auch des E2F 1 Promoters und die Lokalisation von E2F 4 in den Zellkern Hauptaufgaben von E4orf6/7 sind. Um die Auswirkungen der SUMOlierung von E4orf6/7 auf die bekannten Funktion(en) zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit Plasmid und Virus Mutanten generiert, bei denen Lysin Reste durch Arginin Reste substituiert wurde. Mittels dieser E4orf6/7 Varianten war es uns möglich zu zeigen, dass E4orf6/7 am Lysin-Rest 68 SUMOliert wird. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass die Substitution in der E4orf6/7 K68R Mutante keine Auswirkung auf die Transaktivierung des E2A oder des E2F 1 Promotors hat. Ebenso konnte keine Veränderung in der Lokalisierung von E4orf6/7 und dessen Interaktionspartnern detektiert werden. Es wurde jedoch wiederholt festgestellt, dass die Stabilität der K68R Mutante substanziell verringert ist. Weiterhin war es möglich, einen E2F 1 Promoter vor dem Gen FAM111B zu identifizieren und zu zeigen, dass die FAM111B mRNA Menge im Verlauf der HAdV 5 K68R Infektion stark erhöht ist. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die SUMOlierung nicht nur die Stabilität von E4orf6/7 beeinflusst, sondern auch, dass der SUMO Status von E4orf6/7 für die Repression des FAM111B Promotors und vermutlich anderer zellulärer Promotoren, oder die spezifische Stabilisierung von mRNA notwendig ist.