Characterization of two novel kinesin-14 subfamilies from Arabidopsis thaliana

Abstract

The minus end-directed kinesin-14 family is the largest kinesin subfamily in Arabidopsis thaliana (At, A. thaliana). Twenty-one members enable different, partially plant-specific functions. This thesis deals with different Atkinesin-14 members that were analyzed concerning their structures, properties, functions, and localization to gain an insight into possible physiological roles. One subgroup of Atkinesin-14 motors (AtBARK) has an internal motor domain flanked by coiled-coil domains and an N-terminal F-BAR domain. The results of this thesis showed that AtBARK1 and AtBARK2 are minus end-directed, non-processive motors with membraneand microtubule-sensing and binding properties. Moreover, they are able to transport vesicles along microtubules with a distinct velocity. Further experiments showed a high sequence similarity of the two proteins and an expression in pollen. Analyses of one bark1 T-DNA insertion line offered pollen, silique, and seed phenotypes. Taken together, these results indicate an involvement of AtBARK proteins in endocytosis during pollen tube growth. The motors of the second subgroup - containing an N-terminal motor domain - were named AtMISK. In vitro analyses showed that AtMISK1 - without its tail domain - is a minus enddirected, non-processive and diffusive motor. AtMISK1 stably crosslinks or slides microtubules depending on their polarity. Further analyses showed an expression in the xylem tissue of roots. Taken together, these results indicate a role in the rearrangement of the cytoskeleton for cell wall development in differentiating xylem tissue of the root. These analyses of the subgroups AtBARK and AtMISK demonstrate the diversity of the Atkinesin-14 family due to different domain structures and organization, expression areas, properties, and functions. These differences suggest that this large group could be further subdivided. The following classification might be possible: (1) archetypic kinesin-14 motors with a C-terminal motor domain and putative functions in cell division (AtKatA-C, AtKin-14D); (2) plant-specific kinesin-14 motors with an N-terminal (AtMISK1-2, AtKin-14S) or an internal motor domain (AtDGBLK, AtDGBK) flanked by one coiled-coil domain; (3) kinesins with an internal motor domain flanked by two coiled-coil domains (AtKCH1-7, AtBARK1-2).

Die minusendgerichtete Kinesin-14 Familie ist mit 21 Mitgliedern, die verschiedene, teilweise pflanzenspezifische Funktionen ausführen, die größte Kinesin Unterfamilie in Arabidopsis thaliana (At, A. thaliana). In dieser Arbeit werden verschiedene AtKinesin-14 Mitglieder bezüglich ihrer Strukturen, Eigenschaften, Funktionen und Lokalisation untersucht, um eine Vorstellung von möglichen physiologischen Rollen zu erhalten. Eine Untergruppe der AtKinesin-14 Motoren (AtBARK) zeichnet sich strukturell durch eine interne Motordomäne flankiert von ‘Coiled-coil‘ Domänen und einer N-terminalen F-BAR Domäne aus. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass AtBARK1 und AtBARK2 minusendgerichtete, nicht prozessive Motoren sind, die Membranen und Mikrotubuli erkennen und binden. Zudem transportieren sie Vesikel entlang von Mikrotubuli. Weitere Analysen ergaben eine hohe Sequenzähnlichkeit beider Proteine und eine Expression in Pollen. Eine bark1 T-DNA Insertionslinie zeigte einen Phänotyp bezüglich Pollen-, Schotenund Samenentwicklung. Diese Ergebnisse könnten auf eine Rolle von AtBARK Proteinen während der Endozytose im wachsenden Pollenschlauch hinweisen. Die zweite Untergruppe (AtMISK) umfasst pflanzenspezifische AtKinesin-14 Motoren mit einer N-terminalen Motordomäne. Eigene in vitro Analysen haben gezeigt, dass AtMISK1 ohne seinen ‘Tail‘ ein minusendgerichteter, nicht prozessiver, diffusiver Motor ist. AtMISK1 kann Mikrotubuli, abhängig von ihrer Polarität, stabil quervernetzen oder aneinander entlang verschieben. Weitere Analysen zeigten eine Expression im Wurzelxylem. Diese Ergebnisse könnten auf eine Rolle in der Zytoskelettorganisation während der Zellwandentwicklung im Wurzelxylem hinweisen. Wie anhand der zwei untersuchten Gruppen zu sehen, umfasst die AtKinesin-14 Familie Motoren, die unterschiedliche Domänenstrukturen und -organisation, Expressionsorte, Eigenschaften und Funktionen aufweisen. Aufgrund dieser Unterschiede könnte diese große Gruppe in folgende Untergruppen unterteilt werden: (1) archetypische Kinesin-14 Motoren mit C-terminaler Motordomäne und möglicher Funktion in der Zellteilung (AtKatA-C, AtKin-14D); (2) pflanzenspezifische Kinesin-14 Motoren mit N-terminaler (AtMISK1-2, AtKin-14S) oder interner Motordomäne (AtDGBLK, AtDGBK) flankiert von einer ‘Coiled-coil‘ Domäne; (3) Kinesin-14 Motoren mit einer internen Motordomäne flankiert von zwei ‘Coiled-coil‘ Domänen (AtKCH1-7, AtBARK1-2).