Einfluss der Ubiquitin spezifischen Protease 7 auf den Lebenszyklus des Merkel Zell Polyomavirus

Abstract

Das Merkel Zell Polyomavirus (MCPyV) ist eines von bislang 13 humanen Polyomaviren und wurde 2008 in Merkel Zell Karzinomen (MCC) entdeckt. Zahlreiche Studien konnten inzwischen das MCPyV als Hauptursache für die Entstehung desMCCidentifizieren. Damit ist das MCPyV das bisher einzige humane Polyomavirus, welches eine Rolle bei der Tumorgenese im Menschen spielt. Das Virus persistiert asymptomatisch in einem Großteil der Bevölkerung, vermutlich in dermalen Fibroblasten. So tragen 42 - 80 % aller Menschen Antikörper gegen das Hauptkapsidprotein des Virus und die virale DNA kann in Hautabstrichen bei 40 - 94 % aller Menschen nachgewiesen werden. Während des natürlichen Lebenszyklus des Virus werden die sogenannten Tumorantigene, Large T-Antigen (LT) und small T-Antigen (sT), von der frühen Region des viralen Genoms exprimiert. Das LT spielt die zentrale Rolle der viralen DNA-Replikation durch Binden an den viralen Replikationsursprung (ori) sowie Regulation des Zellzyklus, unterstützt durch sT. Im Gegensatz zu einem permissiven Lebenszyklus ist im MCC das MCPyV Genom in das Wirtsgenom von 80 - 90 % aller Tumore monoklonal integriert. Der Zelltyp in dem die initiale Integration des Genoms stattgefunden hat, ist bislang jedoch nicht identifiziert, d. h. die Ursprungszelle des MCC ist unbekannt. Tumorspezifische Mutationen in der frühen Region des integrierten MCPyV Genoms führen zu einem replikationsinkompetenten Virus, welches ein verkürztes LT (tLT) und das sT exprimiert, aber keine Viruspartikel produziert. Die jedoch weiterhin vorhandene Zellzyklusregulation durch die T-Antigene, allem voran die Inaktivierung des Retinoblastomaproteins, trägt entscheidend zur Transformation der Zelle bei. Das resultierende MCC ist eine seltene jedoch hoch-aggressive Hautkrebsart, die vor allem ältere und immunsupprimierte Menschen betrifft. Es gibt zurzeit keine spezifische Behandlungsmöglichkeit, so dass die Fünf-Jahres-Überlebensrate, abhängig vom initialen Metastasierungsstatus des Tumors, unter 40 % liegt. Die Aufklärung der Interaktionen der T-Antigene des MCPyV mit zellulären Faktoren zur Replikation des Virus wie auch Transformation von Zellen spielt eine zentrale Rolle zum Verständnis der Biologie dieses Virus. Durch die darauf beruhende Entwicklung von in vitro Replikations- und Transformationssystemen können mögliche therapeutische Interventionen zielgerichtet entworfen und getestet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Ubiquitin spezifische Protease 7 (Usp7) als neuer zellulärer Interaktionspartner des MCPyV LT identifiziert. Usp7 ist ein Deubiquitinierungsenzym mit zahlreichen zellulären Zielproteinen wie z. B. p53, Mdm2, FoxO4 oder PTEN. Darüber hinaus beeinflusst Usp7 den Lebenszyklus von persistierenden DNA-Viren wie KSHV, EBV, HSV-1 und AdV und spielt außerdem eine Rolle bei der Transformation von Zellen durch EBV und AdV. GST-Pulldown Experimente dieser Arbeit zeigen mit Zelllysaten sowie aufgereinigten Proteinen eine direkte Interaktion der N-terminalen TRAF-Domäne von Usp7 mit dem N- als auch dem C-Terminus des MCPyV LT. Während der Replikation des MCPyV wird Usp7 durch seine Interaktion mit LT in die DNA-Replikationszentren des Virus delokalisiert, wo es einen positiven Einfluss auf die virale Replikation ausübt. Reduzierte Usp7 Protein Mengen oder eine Abwesenheit der Usp7 Expression führt zu signifikant reduzierter viraler DNAReplikation und darüber hinaus verminderter viraler Genexpression, in der vollständigen Abwesenheit von Usp7. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, das Usp7 die Bindungskapazität des LT an den viralen Replikationsursprung verstärkt, was durch Electrophoretic Mobility Shift Assays belegt wird. Die gesteigerte Bindung von LT an den Replikationsursprung unterstützt daraufhin die virale DNA-Replikation und Genexpression. Weitere Untersuchungen zur Aufklärung des molekularen Mechanismus zeigen, dass Usp7 LT in vitro deubiquitiniert, in vivo kann jedoch kein signifikanter Effekt auf die Proteinlevel und die Ubiquitinierung von LT nachgewiesen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit Usp7 als ein neuer zellulärer positiver Regulator der MCPyV DNA-Replikation und Genexpression identifiziert werden. Darüber hinaus liefert diese Arbeit Hinweise auf einen bislang unbekannten Mechanismus wie Usp7 die Initiierung der DNA-Replikation eines humanen Polyomavirus wahrscheinlich unabhängig von seiner Deubiquitinierungsfunktion unterstützen könnte.

The Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) is one of 13 human Polyomaviruses known to date. The virus was originally discovered in 2008 in Merkel cell carcinomas (MCCs). Since then various studies verified the MCPyV as the major cause for the development of MCC. Thus, MCPyV represents the only human Polyomavirus known to be involved in human cancer development. The virus persists asymptomatically in the majority of the population; most likely dermal fibroblasts are the cells of a life long persistence. 42 – 80 % of the human population are seropositive for antibodies recognizing the major capsid protein of the virus. In addition, viral DNA can be isolated from skin swabs of 40 – 94 % of humans. During the natural life cycle of the virus the so called tumor antigens, Large T-antigen (LT) and small T-antigen (sT), are expressed from the early region of the viral genome. LT plays the central role in the viral DNA replication by binding to the viral origin of replication (ori) and regulating the cell cycle supported by sT. In contrast to the permissive lifecycle, in MCC the MCPyV genome is monoclonally integrated in the host genome in 80 – 90 % of all tumors. However, the cell type of the initial integration of the genome has not been identified so far. Thus, the cell of origin giving rise to MCC is unknown. Tumor specific mutations in the early region of the integrated MCPyV genome lead to a replication incompetent virus which expresses a truncated LT (tLT) and the sT, but does not produce viral particles. However, the continued cell cycle regulation by the T-antigens, especially the inactivation of the retinoblastoma protein, significantly contributes to transformation of the cell. The resulting MCC is a rare but highly aggressive skin cancer that affects mostly elderly and immunosuppressed patients. Currently there is no specific treatment for MCC. The 5-year survival rate depending on the initial stage of metastasis is below 40 %. Interaction studies of the MCPyV T-antigens with cellular factors for viral replication and transformation are of substantial interest for understanding the biology of this virus. Based on these findings the development of in vitro systems for replication and transformation is an important prerequisite in the design and evaluation of putative MCC specific therapeutic strategies. In this study the Ubiquitin specific protease 7 (Usp7) was identified as a novel cellular interaction partner of the MCPyV LT. Usp7 is a deubiquitination enzyme with numerous cellular targets, e. g. p53, Mdm2, FoxO4 or PTEN. Furthermore, Usp7 influences the life cycle of persistent DNA viruses, e. g. KSHV, EBV, HSV-1 and AdV and is also involved in the transformation of cells by EBV and AdV. Within this study, GST pulldown experiments using cell lysates or purified proteins demonstrate a direct interaction between the N-terminal TRAF domain of Usp7 and the N- as well as C-terminus of MCPyV LT. During the MCPyV replication cycle Usp7 is delocalized to viral DNA replication centers through its interaction with LT where it significantly enhances the viral replication. Reduced Usp7 protein level or a complete absence of Usp7 protein expression significantly decreases viral DNA replication and additionally viral gene expression in cells devoid of Usp7 expression. The results obtained in this study suggest that Usp7 enhances the binding capacity of LT to the viral origin of replication as shown by electrophoretic mobility shift assays. Increased binding of LT to the viral origin of replication supports viral DNA replication and viral gene expression. Further investigations to elucidate the molecular mechanism show that Usp7 deubiquitinates LT in vitro, however significant changes of LT protein amounts and LT ubiquitination levels were not observed in vivo. In summary, this study identifies Usp7 as a novel positive cellular regulator of MCPyV DNA replication and gene expression. Moreover, this study indicates a hitherto unknown mechanism by which Usp7 could possibly support the initiation of viral DNA replication of a human polyomavirus independent of its deubiquitination function.