Establishing structural characterization of noroviruses by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS)

Abstract

Over the last twenty years, mass spectrometry (MS) has more and more entered the field of structural virology aiming to investigate the structure and dynamics of viral proteins as close to their native environment as possible. The use of non-perturbing labels in hydrogen-deuterium exchange (HDX) MS allows for the analysis of interactions between viral proteins and host cell factors as well as their dynamic responses to the environment. Infection with norovirus is the leading cause of acute gastroenteritis worldwide. Attachment of human norovirus to histo blood group antigens (HBGAs) is essential for infection, but how this binding event promotes the infection of host cells is unknown. HBGA binding to the norovirus capsid is mediated by the P domain of the viral capsid protein VP1 which bind glycans in a strain-dependet manner, with fucose as minimal binding motif. To track strain-specific structural changes on norovirus P dimers upon glycan binding that could hypothetically prime for cellular uptake, an HDX-MS workflow was established. A first set of experiments aimed to investigate the structural impact of a highly selective spontaneous transformation of asparagine 373 into an iso-aspartate residue, located in a loop adjoining the HBGA binding site. This post-translational modification (PTM) proceeds with an estimated half-life of a few days at physiological temperatures. N373 deamidation increases protein dynamics in the HBGA binding pocket and strongly attenuates HBGA recognition in fully deamidated P dimers. Sequence conservation and the surface-exposed position of this PTM suggest an important role in infection and immune recognition for many norovirus strains, especially those of the pandemic genogroup GII.4. In a second set of experiments, HDX-MS was used to investigate glycan-induced structural dynamics in P dimers of different norovirus strains, which exhibit high structural similarity but different prevalence in humans. While the almost identical strains GII.4 Saga and GII.4 MI001 share similar glycan-induced dynamics, the dynamics differ in the emerging GII.17 Kawasaki 308 and rare GII.10 Vietnam 026 strain. Structural effects of N373 deamidation upon glycan binding were also investigated in partially deamidated GII.4 P dimers, which are likely present during infection. These mixed species exhibit increased solvent exposure in the P2 domain of the P dimer upon glycan binding in contrast to pure wild type. Furthermore, deamidated P dimers display increased flexibility and dissociation into monomers. The results indicate that glycan binding induces strain-dependent structural dynamics, which are further altered by N373 deamidation. Therefore, a role of deamidation in modulating cell attachment and entry in GII.4 strains can be supposed. The standard HDX-MS workflow was also adapted for the investigation of protein-membrane interactions. Using the membrane protein Mistic as a model protein, dynamics in different lipid and detergent environments were investigated. HDX-MS results show that three regions of the protein have significant deuterium uptake differences in lipid vesicles and detergent micelles, with two of these regions displaying bimodal peak distributions. The deuteration differences imply that Mistic conformation and dynamics are influenced by lipid properties, which could have some implications on the biological function. The HDX-MS workflow established here enables structural dynamics studies of viral proteins in solution as well as in more challenging environments, paving the way for further HDX-MS measurements with virus-like particles and infectious virions and their interactions with membrane-displayed glycans.

In den letzten zwanzig Jahren hat die Massenspektrometrie (MS) mehr und mehr Einzug in den Bereich der Strukturvirologie gehalten mit dem Ziel, die Struktur und Dynamik viraler Proteine so nah wie möglich an ihrer nativen Umgebung zu untersuchen. Die Verwendung von nicht-störenden Markierungen im Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX) MS ermöglicht die Analyse von Wechselwirkungen zwischen viralen Proteinen und Wirtszellfaktoren sowie deren dynamische Reaktionen auf die Umgebung. Die Infektion mit dem Norovirus ist weltweit die Hauptursache für akute Gastroenteritis. Die Anheftung des Norovirus an Histo-Blutgruppenantigene (HBGAs) ist für die Infektion im Menschen essentiell, wie jedoch dieses Bindungsereignis die Infektion von Wirtszellen fördert, ist unbekannt. Die HBGA-Bindung an das Norovirus-Kapsid wird durch die P-Domäne des viralen Kapsidproteins VP1 vermittelt, die Glykane stammabhängig bindet. Fucose dient hierbei als minimales Bindungsmotiv. Um stammspezifische Strukturveränderungen an Norovirus-P-Dimeren bei der Glykanbindung zu verfolgen, die hypothetisch zur zellulären Aufnahme führen könnten, wurde ein HDX-MS-Workflow etabliert. Eine erste Reihe von Experimenten zielte darauf ab, die strukturellen Auswirkungen einer hochselektiven spontanen Transformation von Asparagin 373 in einen Iso-Aspartat-Rest zu untersuchen, welcher sich in einer an die HBGA-Bindungsstelle angrenzenden Loop-Struktur befindet. Diese posttranslationale Modifikation (PTM) verläuft bei physiologischen Temperaturen mit einer geschätzten Halbwertszeit von wenigen Tagen. Die Deamidierung von N373 erhöht die Proteindynamik in der HBGA-Bindungstasche und schwächt die HBGA-Erkennung in vollständig deamidierten P-Dimeren stark ab. Die Sequenzkonservierung und die oberflächenexponierte Position dieser PTM deuten auf eine wichtige Rolle bei der Infektion und Immunerkennung für viele Norovirusstämme hin, insbesondere für die der pandemischen Genogruppe GII.4. In einer zweiten Versuchsreihe wurde HDX-MS zur Untersuchung der glykaninduzierten Strukturdynamik in P-Dimeren verschiedener Norovirusstämme verwendet, die eine hohe strukturelle Ähnlichkeit, aber eine unterschiedliche Prävalenz beim Menschen aufweisen. Während die fast identischen Stämme GII.4 Saga und GII.4 MI001 eine ähnliche glykaninduzierte Dynamik aufweisen, unterscheidet sich die Dynamik bei dem neu auftretenden Stamm GII.17 Kawasaki 308 und dem seltenen Stamm GII.10 Vietnam 026. Die strukturellen Auswirkungen der N373-Deamidierung auf die Glykanbindung wurden auch an teilweise deamidierten GII.4 P-Dimeren untersucht, die wahrscheinlich während der Infektion vorhanden sind. Diese gemischten Spezies zeigen im Gegensatz zum reinen Wildtyp eine erhöhte Lösungsmittelexposition in der P2-Dömane des P-Dimers bei der Glykanbindung. Des Weiteren zeigen deamidierte P-Dimere eine erhöhte Flexibilität und Dissoziation in Monomere. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Glykanbindung eine stammabhängige Strukturdynamik induziert, die durch die N373-Deamidierung weiter modifiziert wird. Daher kann eine Rolle der Deamidierung bei der Modulation der Zellanheftung und des Zelleintritts in GII.4-Stämmen vermutet werden. Der Standard-HDX-MS-Workflow wurde auch für die Untersuchung von Protein-Membran-Interaktionen angepasst. Mit dem Membranprotein Mistic als Modellprotein wurde die Dynamik in verschiedenen Lipid- und Detergensumgebungen untersucht. Die Ergebnisse der HDX-MS zeigen, dass drei Regionen des Proteins signifikante Unterschiede in der Deuteriumaufnahme in Lipidvesikeln und Detergens-Mizellen aufweisen, wobei zwei dieser Regionen durch bimodale Signalverteilungen gekennzeichnet sind. Die Deuterierungsunterschiede implizieren, dass die Konformation und Dynamik von Mistic durch die Lipideigenschaften beeinflusst werden, was einige Auswirkungen auf die biologische Funktion haben könnte. Der hier etablierte HDX-MS-Workflow ermöglicht strukturdynamische Studien viraler Proteine sowohl in Lösung als auch in anspruchsvolleren Umgebungen und ebnet damit den Weg für weitere HDX-MS-Messungen mit virusähnlichen Partikeln und infektiösen Virionen und deren Wechselwirkungen mit membranständigen Glykanen.