Beitrag axialer und radialer Parenchyme zur Kernholzbildung in Robinia pseudoacacia L.

Abstract

Die obligate Kernholzbildung in den innersten, lebenden Xylemgeweben vieler Bäume ist einer der ökologisch und ökonomisch wichtigsten sekundären Differenzierungsprozesse verholzter Achsen. Der Prozess ist genetisch determiniert und wird von endogenen wie exogenen Faktoren beeinflusst. Das herausragende Charakteristikum des Kernholzes sind die Kerninhaltsstoffe, die dem Holz seine dunklere Farbe und eine „natürliche Dauerhaftigkeit“ verleihen. Zu den wichtigsten Kerninhaltsstoffen der Robinie gehören die Flavonoide Robinetin und Dihydrorobinetin. Diese verleihen dem Holz eine Resistenz gegenüber holzzerstörenden Pilzen und Mikroorganismen. Die Flavonoide akkumulieren in situ im Parenchymgewebe der Splint-Kern-Übergangszone. Phenylalanin-Ammonium-Lyase (PAL) als Eingangsenzym des Phenylpropanstoffwechsels und Chalkonsynthase (CHS) als wichtigstes Enzym der Flavonoidbiosynthese nehmen dabei Schlüsselpositionen ein. Die codierenden Gene gelten daher als Markergene der obligaten Farbkernbildung und weisen in den Sommer- und Herbstmonaten einen saisonalen Expressionshöhepunkt in der Splint-Kern-Übergangszone auf. Der Prozess der obligaten Kernholzbildung endet mit dem programmierten Zelltod der beteiligten Parenchyme. An Robinia pseudoacacia L., einem Modellbaum der obligaten Kernholzbildung, wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit die Verwendbarkeit von zwei Genen 14-3-3 und heat shock 70 als Markergene untersucht. Beide Genfamilien werden in Zusammenhang mit Signaltransduktionswegen, Transportprozessen und der Stressantwort genannt. Ein Zusammenhang mit der Farbkernbildung wird von Autoren verschiedener Veröffentlichungen vermutet. Sie gelten somit als Kandidatengene der Kernholzbildung. Mithilfe von Amplifikation mittels PCR, Klonierung und Sequenzierung konnten drei 14-3-3 Genfragmente (Rp14-3-3Gen1-3) und ein heat shock Genfragment (RpHS70) identifiziert werden. Anhand weiterführender Genexpressionsstudien mittels Real-Time PCR konnten Transkripte beider Genfamilien in sämtlichen Xylemgeweben sowie im Phloem der Robinie zu allen Jahreszeiten nachgewiesen werden. Die Transkriptmengen erwiesen sich dabei als sehr niedrig in Vergleich zum eingesetzten 18S Referenzgen. Ein für Markergene typischer, saisonaler Expressionspeak in der Splint-Kern-Übergangszone konnte in den Sommer- und Herbstmonaten nachgewiesen werden, wobei die Transkriptmengen vorwiegend niedriger als in den äußeren Geweben waren. Weder Rp14-3-3 noch RpHS70 können daher als Markergene der obligaten Kernholzbildung eingesetzt werden. Ein Zusammenhang mit diesem Prozess ist dennoch wahrscheinlich. Bisherige molekularbiologische Untersuchungen zur Kernholzbildung betrachteten allein das Gesamt(parenchym)gewebe der Splint-Kern-Übergangszone. Mikroskopische und biochemische Studien gehen jedoch von unterschiedlichen Beiträgen von axialen und radialen Parenchymen aus. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode zur Lasermikrodissektion entwickelt, die eine getrennte Aufarbeitung von Axial- und Radialparenchym erlaubt. Dabei wurden zunächst Mikrotomschnitte angefertigt und mittels einer Zuckerlösung auf einen Objektträger fixiert. Die Dünnschnitte wurden gefriergetrocknet, die endgültige Fixierung erfolgte im Anschluss mit Klebestreifen. Nach separater Dissektion von Axial- bzw. Radialparenchym aus der Splint-Kern-Übergangszone erfolgte die Extraktion der RNA, reverse Transkription zu cDNA sowie die Amplifikation des Transkriptoms. Vergleichende Genexpressionsstudien an den Markergenen PAL und CHS sowie den Genen HS70 und 14-3-3 anhand von cDNA, erhalten aus (1) Axialparenchym, (2) Radialparenchym sowie (3) dem Gesamtgewebe der Splint-Kern-Übergangszone bestätigen die bereits vermutete Dominanz des Strahlparenchyms während der obligaten Farbkernbildung. Die Expressionsmuster von (2) und (3) gleichen sich in qualitativer Hinsicht sehr stark. Im Axialparenchym konnten keinerlei Transkripte der Kandidatengene HS70 und 14-3-3 sowie der Markergene PAL und CHS nachgewiesen werden, was zu der Schlussfolgerung führt, dass allein radiale Parenchyme der Splint-Kern-Übergangszone an der Flavonoidbiosynthese beteiligt sind.