Untersuchungen zu Funktion und Transport lysosomaler Enzyme am Mausmodell (mus musculus) der lysosomalen SpeichererkrankungMucolipidose Typ II

Abstract

Die GlcNAc-1-Phosphotransferase katalysiert den ersten Schritt bei der Synthese von Mannose-6-Phosphat (M6P)-Resten an löslichen lysosomalen Enzymen. Diese posttranslationale Modifikation ist essentiell für den effektiven, intrazellulären Transport lysosomaler Enzyme zu Lysosomen. Mutationen im GNPTAB-Gen, das die α- und β-Untereinheiten der GlcNAc-1-Phosphotransferase kodiert, führen zur lysosomalen Speichererkrankung Mucolipidose Typ II (MLII). In MLII-Zellen werden neu synthetisierte lysosomale Enzyme aufgrund fehlender M6P-Erkennungssignale fehlsortiert und sezerniert, was die intrazelluläre Defizienz dieser Enzyme in Lysosomen und die nachfolgende Akkumulation von nicht-abbaubaren Speichersubstanzen zur Folge hat. MLII ist klinisch durch schwere psychomotorische und mentale Retardierung, Skelettdeformitäten und kardio/respiratorische Komplikationen charakterisiert, was zum frühzeitigen Tod führt. Durch die Einführung einer Patientenmutation an orthologer Stelle im murinen Gnptab- Gen wurde ein Mausmodell für MLII (Gnptabki) generiert. In der vorliegenden Arbeit konnten durch massenspektrometrische und immunhistologische Analysen von neuronalem Gewebe der Gnptabki-Mäuse die Akkumulation von fucosylierten und Mannose-reichen N-Glycanen, von Bis(monoacylglycero)phosphat, Cholesterin und GM1- und GM2-Gangliosiden identifiziert werden. In embryonalen Mausfibroblasten von Gnptabki-Mäusen war zusätzlich die Speicherung von Glycosaminoglycanen nachweisbar. Die Identifizierung des Speichermaterials und biochemische Analysen zu Transport und Lokalisation lysosomaler Enzyme zeigten, dass die α-L-Fucosidase, α-Mannosidase, β- Galactosidase, β−Hexosaminidase, Cathepsin Z und das Cholesterin-bindende Protein Npc2 ausschließlich M6P-abhängig zu den Lysosomen transportiert werden und somit den lysosomalen Abbau von Substraten spezifisch limitieren. Andere lysosomale Enzyme, wie Cathepsin D, Cathepsin B und saure Sphingomyelinase, werden in Gnptabki-MEFs partiell über M6P-unabhängige Transportwege zu Lysosomen transportiert. Um zu untersuchen, ob Sortilin als alternativer Transportrezeptor für den M6P-unabhängigen Transport lysosomaler Enzyme zu den Lysosomen verantwortlich ist, wurden zunächst Gnptabki-Mäuse mit Sortilin-defizienten (Sko)-Mäusen gekreuzt. In Fibroblasten aus Gnptabki/Sko-Mäusen war kein additiver Effekt auf die Fehlsortierung von Cathepsin D, B und saurer Sphingomyelinase zu Lysosomen feststellbar. Endozytoseexperimente mit nicht-phosphoryliertem Cathepsin D und Cathepsin B zeigten hingegen, dass diese lysosomalen Proteasen über Rezeptoren der LDLRezeptorfamilie, bevorzugt LRP1, an der Plasmamembran internalisiert werden. Diese Daten unterstützen die Annahme, dass neu synthetisierte lysosomale Enzyme in Gnptabki-Fibroblasten im Golgi-Apparat nicht an M6P-Rezeptoren binden und sezerniert werden, um anschließend über Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie an der Zelloberfläche wieder in die Zellen aufgenommen und zu Lysosomen transportiert zu werden (secretion-recapture Mechanismus). Schließlich wurden in dieser Arbeit pathologische Veränderungen im Hirn und Pathomechanismen der Neurodegeneration in Gnptabki-Mäusen analysiert. Neben dem progressiven Verlust der Purkinje-Zellschicht und Demyelinisierungsprozessen im Cerebellum waren Astrogliosen und Mikrogliosen im gesamten Hirn der Gnptabki- Mäuse feststellbar. Die Störung der basalen Autophagie kann für den neuronalen Zelltod verantwortlich gemacht werden. Die Gnptabki-Maus kann als hervorragendes, experimentelles Modell für die Untersuchungen von Pathomechanismen der Neurodegeneration angesehen werden, die nicht nur die Etablierung neuer therapeutischer Konzepte für diese Erkrankung erlauben, sondern die auch auf andere lysosomale Speichererkrankungen mit ähnlichen Symptomen übertragbar sind. Außerdem bieten isolierte Zellen dieser Mäuse die Möglichkeit, neue Transportwege lysosomaler Proteine zu Lysosomen und ihre Regulation zu untersuchen, die für verbesserte und gezielte Enzymersatztherapien bei lysosomalen Erkrankungen von Bedeutung sind.