Quantifizierung von zirkulierenden mikroRNAs im Blut von Mammakarzinom-Patientinnen und ihre Evaluierung als neuer Blut-basierter Tumormarker

Abstract

Das Mammakarzinom ist trotz Fortschritten in der Früherkennung und Behandlung, die Hauptursache für den krebsbedingten Tod von Frauen weltweit. Dabei ist eine optimale, individuelle Therapie für die Patientinnen wichtig, die momentan hauptsächlich auf der molekularen Klassifikation des Mammakarzinoms beruht. Um invasive Gewebebiopsien und Feinnadelaspirationen zu vermeiden, ist es von Interesse, einen Blut-basierenden Marker, der sich als „flüssige Biopsie“ eignen könnte, zu etablieren. Auf Grund ihrer Stabilität im Blut und ihrer vielfältigen Aufgaben in der Karzinogenese, wurden im Rahmen der vorliegenden Dissertation zirkulierende mikroRNAs (miRs) im Serum von Mammakarzinompatientinnen quantifiziert. Im ersten Teil wurden die relativen Serumkonzentrationen von sechs mikroRNAs (miR-10b, miR-17, miR-34a, miR-93, miR-155 und miR-373) mittels Real-Time PCR bei gesunden Frauen und postoperativen Mammakarzinompatientinnen quantifiziert. Die Analysen zeigten einen signifikanten Anstieg der zirkulierenden miR-34a und miR-93 im Serum von postoperativen Mammakarzinompatientinnen im Vergleich zu gesunden Frauen und eine Verringerung der Konzentrationen der miR-17 und miR-155 in metastasierten Patientinnen. Die Serumkonzentrationen der miR-373 waren signifikant höher bei Patientinnen mit einem primären oder metastasierten Mammakarzinom als bei gesunden Frauen und signifikant mit dem HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor) Status der Mammakarzinome assoziiert. In funktionellen Studien konnte gezeigt werden, dass die Proteinexpression des Hyaluronsäure-Rezeptors CD44 durch miR-373 inhibiert wurde, was die beschriebene Assoziation des Verlustes von CD44 mit der Induktion von Lungenmetastasen erklären könnte. Auf Grund dieser interessanten Aspekte wurden die Konzentrationen der zirkulierenden miR-373 in präoperativen Serumproben von Patientinnen mit einer benignen Brusterkrankung und von Patientinnen mit einem invasiven Mammakarzinom quantifiziert. MiR-373 liegt mit miR-371 und miR-372 in einem chromosomalen Cluster. Um mehr über die Expression des Clusters zu erfahren, wurden miR-371, miR-372, miR-373 und zusätzlich miR-101 untersucht. MiR-101 wurde wegen ihrer Rolle im Estrogen-unabhängigen Wachstum von Mammakarzinomzelllinien ausgewählt. Die miR-101 und miR-373 Serumkonzentrationen waren signifikant unterschiedlich zwischen Patientinnen mit einem Mammakarzinom und einer gutartigen Brusterkrankung. Obwohl miR-371, miR-372 und miR-373 im gleichen Cluster liegen, konnte die zirkulierende miR-371 im Serum nicht nachgewiesen werden, während sich die Serumkonzentrationen der miR-372 zwischen den Patientinnen mit einer benignen und malignen Krankheit nicht unterschieden. Die Konzentrationen dieser mikroRNAs wurden zudem in Exosomen untersucht, da mikroRNAs auch durch aktive Sekretion der Zellen ins Blut ausgeschüttet werden. Interessant sind die hohen exosomalen Serumkonzentrationen der miR-101, miR-372 und miR-373, die vermuten lassen, dass miR-101, miR-372 und miR-373 vorwiegend in Exosomen im Blut zirkulieren. In den Exosomen waren die Mengen der miR-101 und miR-372 bei Mammakarzinompatientinnen erhöht. Die zirkulierenden, exosomalen Konzentrationen der miR-373 waren höher bei Estrogen- Rezeptor- und Progesteron-Rezeptor-negativen Tumoren als bei den entsprechenden Rezeptor-positiven Patientinnen. In funktionellen Studien konnte miR-373 zudem die Proteinexpression des Estrogen-Rezeptors inhibieren. Die Assoziation der exosomalen miR-373 mit den aggressiveren Rezeptor-negativen Mammakarzinomen konnte durch funktionelle Analysen unterstützt werden, in denen die miR-373 die durch den Topoisomerase Inhibitor Camptothecin induzierte Apoptose inhibieren konnte. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die zellfreien miR-101 und miR-373 auf Grund ihrer Unterschiede in Patientinnen mit benignen Brusterkrankungen und Mammakarzinomen als Mammakarzinom-spezifische Marker dienen könnten. Außerdem sind die Konzentrationen der miR-373 in Exosomen, wegen ihrer Assoziation mit den aggressiveren Subtypen des Mammakarzinoms, interessant. Neben diesen Studien wurden in einem Teilprojekt PCR-basierte Mikrosatellitenanalysen im Plasma von Mammakarzinompatientinnen durchgeführt. In diesen Analysen wurde der Verlust der Heterozygosität (LOH) an zirkulierenden Tumorsupressoren untersucht und signifikante Korrelationen von LOH an den Markern TIG1, PTEN, Cyclin D2, RB1 und BRCA1 mit HER2-negativen Mammakarzinomen, Lymphknotenmetastasen und einem kürzeren Gesamtüberleben der Mammakarzinompatientinnen entdeckt. Demzufolge spielen nicht nur deregulierte mikroRNAs sondern auch LOH, die beide die Expression von Tumor-spezifischen Genen beeinflussen, in der Pathologie des Mammakarzinoms eine wichtige Rolle.