Coronaviral Polyprotein Nsp7-10 : Proteolytic Processing and Dynamic Interactions within the Transcriptase/Replicase Complex

Abstract

Coronaviruses (CoVs) comprise a group of enveloped (-)ssRNA viruses. SARS-CoV and the currently emerging MERS-CoV characterized by a fatality rate of around 50 % are considered to be a major world-wide health issue with high economic impact. Although most coronaviral infections are comparably harmless for humans (e.g. for HCoV-229E), SARS-CoV and MERS-CoV clearly demonstrated that severe respiratory diseases are likely to be spread by novel highly pathogenic coronavirus species in the future, infecting various animals and humans. The coronaviral main protease has been identified as a suitable target to treat infections, but such compounds did not reach the market yet. A large hypothetical transcriptase/replicase complex (RTC) of coronaviruses is assumed to be another promising drug target, even though its formation remains poorly understood so far. It is established that the RTC essentially involves several mature non-structural-proteins (Nsps) released from the primary polyprotein translation products of the viral RNA by viral proteases, while the impact of their sequentially cleaved polyprotein-precursors is unknown.

Addressing important questions of structure, oligomeric composition and function of polyprotein precursors that may act as putative RTC building blocks, the C-terminus of SARS-CoV polyprotein 1a comprising Nsp7-10 (pp710) was recombinantly produced in E. coli and purified. The homologue protein of the distantly related Alphacoronavirus HCoV-229E that causes common cold was purified for comparison as well. In addition, specific fragments of these large pp710 molecules that were observed along the pathway of processing by a viral main protease in vitro were purified to allow a structural comparison with incompletely cleaved polyprotein intermediates and mature non-structural proteins. For the first time, a complex cleavage reaction of a viral polyprotein was monitored at high mass accuracy by mass spectrometry, revealing for example a 2:2-interaction state of mature SARS-CoV Nsp7 and Nsp8. It was shown that RNA-dependent RNA polymerase activity of Nsp8 does not require a hexadecameric interaction with Nsp7, which was previously reported. Nsp8 is capable of de novo synthesis of RNA fragments (> 10 nt), even in the precursor state covalently linked to Nsp7 and Nsp9. The binding epitope of nucleotides resulting in catalytic activity was characterized for two Nsp8 precursors by saturation transfer difference NMR spectroscopy. The observation of catalytic activity and interaction with nucleic acids promotes the idea of functionally relevant polyproteins acting as RTC building blocks. Furthermore, size exclusion-chromatography and small-angle X-ray scattering (SAXS) demonstrate a concentration-dependant oligomerization of SARS-CoV and HCoV-229E pp710, which is hypothesized to represent a regulatory mechanism during coronavirus infection. A low-resolution structural model for the domain interactions within the monomer of pp710 as well as for the intermolecular dimer interactions is proposed, verified by SAXS data of truncated variants and mass spectrometry of cross-linking experiments. Based on SAXS data it is further suggested that the interaction of Nsp7 and Nsp8 is preformed in the “polyprotein state“, without significant rearrangements during proteolytic maturation.

The high-resolution structure of HCoV-229E Nsp10 was solved by X-ray crystallography, comprising the first Nsp10 structure of an Alphacoronavirus. As demonstrated, Nsp10 containing two highly conserved and occupied Zn2+-binding sites is monomeric in solution. Interaction with Nsp7, Nsp8 or Nsp9 was not observed in a wide frame of experimental conditions. In silico modelling predicts an interaction with HCoV-229E Nsp16 and therefore the modulation of the Nsp16 2’-O-methyltransferase activity similar to that reported for SARS-CoV Nsp10 and Nsp16.

In summary, pp710 as well as its partly processed and full processed maturation products that are assumed to constitute building blocks of the essential coronaviral RTC have been characterized in terms of function and structure applying state-of-the-art methods in structural biology. The direct comparison of equivalent proteins from Alphacoronavirus HCoV-229E and Betacoronavirus SARS-CoV overall revealed a high structural and functional conservation, despite the distant relationship within the Coronaviridae which enlightens conserved key-events in the process of RTC-formation of Alpha- and Betacoronaviruses. Significant differences were only detected in the tertiary structure of pp710 and pp78, according to SAXS.

Coronaviren (CoV) sind membranumhüllte (-)ssRNA Viren, die Menschen bzw. verschiedene Tiere infizieren und in der Regel eher milde Erkältungskrankheiten auslösen. Das SARS-CoV und das sich aktuell ausbreitende MERS-CoV, welches bislang eine Sterblichkeitsrate von etwa 50 % aufweist, repräsentieren jedoch Beispiele, die ein ernstes weltumspannendes Gesundheitsproblem darstellen. Neben den vielen nicht-pathogenen Coronaviren, wie z.B. HCoV-229E, müssen in Zukunft auch weitere Ausbrüche von schweren Atemwegserkrankungen befürchtet werden, die durch neuartige hoch-pathogene Coronaviren, die den Wirt wechseln, ausgelöst werden. Die coronavirale Haupt-Protease wurde bereits als ein Ziel zur Behandlung von Infektionen identifiziert, bisher haben Medikamente allerdings noch keine Marktreife erlangt. Eine weitere perspektivische Zielstruktur könnte der essentielle Transkriptase/Replikase-Komplex (RTC) darstellen, dessen Aufbau unter anderem aus viralen Nicht-Struktur-Proteinen (Nsp) postuliert wird. Die genaue Zusammensetzung des RTC und die Bedeutung der primären Translationsprodukte des Virus, also der Polyproteine, aus denen durch virale Proteasen zunächst teilweise prozessierte Intermediate und final die reifen Nsps sequentiell freigesetzt werden, sind derzeit jedoch nahezu vollständig unbekannt.

Um wichtige Fragestellungen bezüglich der Struktur, der Stöchiometrie von oligomeren Zuständen sowie der Funktion von Polyprotein-Precursorn, die als mögliche Bausteine des RTC fungieren können, wurde ein großer Teil des C-Terminus des SARS-CoV Polyproteins 1a, bestehend aus den vier Domänen Nsp7-Nsp10 (pp710), rekombinant produziert und gereinigt. Das homologe Protein des entfernt verwandten Erkältungserregers HCoV-229E wurde für vergleichende Untersuchungen ebenfalls hergestellt und gereinigt. Zusätzlich wurden spezifische Fragmente isoliert, die während der proteolytischen Prozessierung von pp710 durch die virale Haupt-Protease nachgewiesen wurden, um einen direkten Vergleich mit unvollständig prozessierten Polyprotein-Intermediaten und reifen Nsps zu ermöglichen. Diese komplexe Prozessierungsreaktion wurde im Detail durch native Massenspektrometrie verfolgt, wodurch unter Anderem die Protease-Spezifität und ein 2:2-Interaktionszustand von SARS-CoV Nsp7 und der RNA-Polymerase Nsp8 in Lösung identifiziert werden konnten. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die Polymerase-Aktivität nicht zwingend einen hexadecameren Zustand von SARS-CoV Nsp7 und Nsp8 erfordert, der zuvor postuliert wurde. Bereits im Polyprotein-Zustand vor der N- und C-terminalen Prozessierung ist die Nsp8-Domäne in der Lage, RNA-Fragmente > 10 nt zu synthetisieren. Ein Nukleotid-Bindungsepitop an zwei Nsp8-Vorläuferproteine wurde mittels STD-NMR Spektroskopie charakterisiert. Nachweise einer Interaktion mit Nukleinsäuren und der katalytischen Aktivität bekräftigen die Hypothese, dass unvollständig prozessierte Polyproteine bereits funktionelle Bausteine des RTC mit „vorgeformten“ Struktureigenschaften sein können. Weiterhin wurde durch Größen-Ausschluss-Chromatographie und Röntgen-Kleinwinkel-Beugung (SAXS) eine konzentrationsabhängige Oligomerisierung von SARS-CoV und HCoV-229E pp710 nachgewiesen. Ein strukturelles Modell der Inter-Domänen-Interaktionen im pp710-Monomer sowie der intermolekularen Dimer-Interaktionen wurde mit niedriger Auflösung erstellt und basierend auf SAXS- und MS-Daten verifiziert. Die Modelle legen nahe, dass die Interaktion von „reifem“ Nsp7 und Nsp8 im Polyprotein-Stadium bereits vorgeformt ist, ohne dass während der Prozessierung signifikante Umlagerungen von Nsp7 erforderlich wären.

Des Weiteren wird mit der röntgenkristallographischen Aufklärung der Struktur des HCoV-229E Nsp10, einem vielseitigen regulatorischen Protein, die erste Nsp10-Struktur eines Alphacoronavirus präsentiert. Nsp10 beinhaltet zwei hochkonservierte Zn2+-Bindungsstellen und weist in Lösung einen monomeren Zustand auf. Unter verschiedensten experimentellen Bedingungen konnte keine Interaktion mit reifem Nsp7, Nsp8 oder Nsp9 nachgewiesen werden. Durch in silico Modellierung wurde eine Interaktion von Nsp10 mit HCoV-229E Nsp16 und somit eine Regulation der 2’-O-Methyltransferase-Aktivität von Nsp16 entsprechend der für SARS-CoV berichteten vorhergesagt.

Insgesamt wurden das coronavirale Polyprotein pp710 und teilweise bzw. vollständig prozessierte Spaltprodukte, die als „Bausteine“ des essentiellen RTC postuliert werden, bezüglich ihrer funktionellen und strukturellen Eigenschaften charakterisiert. Der direkte Vergleich entsprechender Proteine des Alphacoronavirus HCoV-229E und des Betacoronavirus SARS-CoV zeigte generell ein hohes Ausmaß an funktioneller und struktureller Konservierung, trotz der Entfernung beider Gruppen innerhalb der Coronavirus-Familie. Signifikante Unterschiede beschränken sich auf die Tertiärstruktur von pp710 und pp78, basierend auf SAXS-Daten.