Regulation und Funktion des schadeninduzierten Polymerase alpha-Primase-p53 Komplexes im ATR/ATR-vermittelten intra-S-Phasen Kontollpunkt in Primatenzellen

Abstract

Eine UVC-Bestrahlung von 10J/m2 am G1/S-Übergang aktiviert den ATR-vermittelten intra-S-Phasen Kontrollpunkt in CV-1 Primatenzellen. Diese spezifische S-Phasen-Schadensantwort, führt direkt nach der UV-Bestrahlung zu einer sechsstündigen Inhibition der DNA-Replikation.

Die UV-spezifische Aktivierung der ATR-Kinase initiiert die Inhibition der Initiation der DNA-Replikation durch Phosphorylierung und Aktivierung der Chk1-Kinase, welche wiederum die Zyklin E-Cdk2 Kinase aktivierende Cdc25A Phosphatase phosphoryliert und somit ihren proteolytischen Abbau induziert. Auf diese Weise bleibt der Zyklin E-Cdk2 Komplex inhibitorisch phosphoryliert, wodurch die Ladung des heterotetrameren DNA-Polymerase alpha-Primase Komplexes (Pol-Prim) an die Replikationsursprünge („origins“) für zwei Stunden verhindert wird. Anschließend erfolgt mittels ATR-katalysierter Phosphorylierung die Stabilisierung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors Delta-p53, welcher durch die Transaktivierung des p21-Promotors die Expression des Cdk-Inhibitors p21 induziert. P21 bindet an den Zyklin A-Cdk2 Komplex und reduziert dadurch dessen Kinase-Aktivität für weitere vier Stunden, wodurch die Bindung der DNA-Polymerase delta an PCNA und konsequenterweise die Elongation der DNA-Replikation verhindert werden. Während dieser sechsstündigen Inhibition der DNA-Replikation findet die Reparatur der UV-Photoprodukte im Genom statt.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte die Interaktion zwischen dem Tumorsuppressorprotein p53 und der DNA-Polymerase alpha (Pol alpha), die Regulation des Komplexes und seine Funktion im Zusammenhang mit der Inhibition der DNA-Replikation nach UV-Bestrahlung aufgeklärt werden.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Tumorsuppressorprotein p53 (wtp53) durch die C-terminalen Aminosäuren (AS) 363 bis 393 seiner basischen Domäne spezifisch mit den N-terminalen AS 102 bis 231 von Pol alpha in vitro interagiert, um den sogenannten Pol-p53-Komplex zu bilden. In vivo wird die Bindung von wtp53 an die Pol alpha-Untereinheit von „origin“-kompetentem Pol-Prim (Origin-Pol alpha) durch die UV-induzierte p21-vermittelte Reduktion der Kinase-Aktivität des Zyklin A-Cdk2 Komplexes im intra-S-Phasen-Kontrollpunkt unabhängig vom Chk1-Status der Zelle gefördert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Pol-p53-Komplex nur stabil ist, solange die Kinase-Aktivität des Zyklin A-Cdk2 Komplexes reduziert bleibt. Nachdem die sechsstündige Inhibition der DNA-Replikation aufgehoben wurde, induziert die ansteigende Kinase-Aktivität des Zyklin A-Cdk2 Komplexes eine konformationale Änderung von Pol-Prim, welche die Dissoziation des Pol-p53 Komplexes einleitet und eine weitere Bindung von wtp53 verhindert.

Die Chk1-Kinase spielt bei der Regulation der Stabilität des Pol-p53-Komplexes insofern eine Rolle, da sie die Aufrechterhaltung der p21-induzierten Reduktion der Zyklin A-Cdk2 Aktivität und somit die Stabilität des Pol-p53 Komplexes positiv beeinflusst.

Da die Akkumulation von Origin-Pol alpha während der UV-induzierten Inhibition der DNA-Replikation mit der Menge an assoziiertem wtp53 korreliert und die Bindung von wtp53 an Origin-Pol alpha sowohl ihre Primase-Aktivität in vitro, als auch ihre Ladung an die „origins“ in vivo inhibiert, ist anzunehmen, dass wtp53 durch Maskierung des N-Terminus von Pol alpha diese vor einer Zyklin A-Cdk2-abhängigen Phosphorylierung und konsequenterweise vor einer Konformationsänderung schützt, welche die Synthese eines RNA/DNA-Primers an den „origins“ induzieren würde. Auf diese Weise wird die „origin“-Kompetenz von Pol-Prim während der gesamten Inhibition der DNA-Replikation im UV-induzierten intra-S-Phasen-Kontrollpunkt bewahrt und nach Aufhebung der sechsstündigen S-Phasen Attenuation die Initiation der DNA-Replikation ermöglicht.

Zusammenfassend gelang es mit dieser Arbeit, einen wesentlichen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Wirkmechanismen zu leisten, die zur vollständigen Inhibition der DNA-Replikation nach UV-Bestrahlung in S-Phasen wtp53 Zellen beitragen, welche die Verdopplung mutierter DNA verhindert und konsequenterweise die Verfestigung von Mutation im Genom unterbindet.