Einfluss des Attenuierungsgrades auf das Sicherheitspotential und die Immunogenität Equiner Herpesvirus Typ1 (EHV-1) basierter Vektoren

Abstract

Der Einsatz viraler Vektorsysteme als rekombinante Vakzine kann durch zahlreiche Faktoren limitiert sein, insbesondere durch (1) präexistierende, gegen den Vektor gerichtete Immunantworten, (2) ein generell geringes immunogenes Potential oder auch (3) stark begrenzte Verpackungskapazitäten für Fremd-Antigene. Alle bisherigen Daten deuten darauf hin, dass gegen das für Menschen apathogene Equine Herpesvirus Typ 1 (EHV-1) keine präexistierende Immunität vorhanden ist. Darüber hinaus waren erste Untersuchungen zum immunogenen Potential des EHV-1-Vektorsystems sehr vielversprechend und zeigten in Balb/c Mäusen systemische Transgen-spezifische zelluläre sowie humorale Immunantworten. In einem heterologen Prime/Boost Schema, bestehend aus einer intramuskulären DNA-Grundimmunisierung und einem zweifachen intranasalen Boost mit EHV-1-Vektoren, wurden zusätzlich auch Transgen-spezifische mukosale Immunantworten induziert, die für die Wirksamkeit eines HIV-Impfstoffes eine große Rolle spielen, da die Mukosa in den meisten Fällen die Eintrittspforte für das HI-Virus darstellt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei unterschiedlich attenuierte EHV-1-Vektor-Varianten eingesetzt: (1) der pathogene RacL-Stamm, der neben respiratorischen Erkrankungen auch Fehlgeburten bei Pferden verursachen kann, (2) das durch 256-faches Passagieren von RacL auf Schweinenierenzellen entstandene hoch attenuierte RacH-Virus und (3) ein von RacH abgeleitetes Virus, bei dem mittels RED-Rekombination das UL-48-Gen gezielt deletiert wurde. UL48 codiert für das eTIF-Protein (equine trans-inducing factor), das als Transaktivator die Expression des einzigen immedate early Proteins von EHV-1 einleitet und damit den Replikationsvorgang initiiert. EHV-ΔUL48-Vektoren sind deshalb in ihrer Replikation stark eingeschränkt, können aber auf einer trans-komplementierenden Zelllinie (RK13-48) hochtitrig vermehrt werden. In die abgestuft attenuierten Vektor-Varianten wurden unterschiedliche Transgene eingesetzt und deren Sicherheit und ihre immunogenen Eigenschaften analysiert. Der Sicherheitsaspekt wurde zum einen anhand der vektor-viralen pathogenen Eigenschaften zum anderen mittels Biodistributions-Analysen von Luciferase-codierenden EHV-1 im Mausmodell beurteilt. Die auf RacH basierenden Vektoren EHV-luc und EHV-luc-ΔUL48 erwiesen sich nach intranasaler Applikation in Balb/c Mäusen als apathogen, wohingegen der auf RacL basierende EHV-L-luc zu reversiblen klinischen Symptomen wie starkem Gewichtsverlust führte. Eine Analyse der Biodistribution durch in vivo Imaging und quantitative Real-Time-PCR zeigte, dass die Vektoren abhängig von der Applikationsroute (intranasal vs. intramuskulär) im entsprechenden Gewebe bzw. Kompartiment verbleiben und sich nicht unkontrolliert im Körper der Maus ausbreiten. Dabei wies EHV-luc sowohl die stärkste Transgen-Expression als auch die höchste Zahl an Genom-Äquivalenten in den Mausgeweben auf. Für Immunisierungsstudien wurden Vektoren hergestellt, die für das HIV-Hüllprotein gp120 codieren. Sowohl EHV-gp120 als auch EHV-gp120-ΔUL48 induzierten in Balb/c Mäusen nach intranasaler Applikation gp120-spezifische zelluläre und humorale Immunantworten. Eine heterologe Prime/Boost Strategie mit einer DNA-Grundimmunisierung und zweifachem intranasalen Boost mit EHV-gp120 induzierte darüber hinaus gp120-spezifische mukosale humorale Immunantworten. Die immunogenen Eigenschaften von EHV-gp120-ΔUL48 erwiesen sich dabei gegenüber EHV-gp120 als deutlich reduziert, was Daten aus früheren Immunisierungsstudien, die mit HIV-gag als Reporterkonstrukt durchgeführt wurden, bestätigte. EHV-1-Vektoren können humane in vitro generierte Dendritische Zellen transduzieren und deren Maturation hervorrufen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die EHV-1-Vektoren auch primäre Monozyten bzw. Makrophagen und B-Zellen transduzieren können und die Expression des codierten Transgens vermitteln. Dies ist zum einen vielversprechend hinsichtlich des Einsatzes EHV-1-basierter rekombinanter Vakzine im Menschen, zum anderen ließen sich EHV-1-Vektoren auch anstelle kostenintensiver Peptide zur Restimulierung von T-Zellen in ex vivo Assays einsetzen. Zur Abschätzung des Impferfolges in einem in vivo Belastungsmodell (Challenge-Modell) wurde in den pathogenen EHV-L-luc-Vektor zusätzlich ein HIV-gag-Gen eingebracht, um damit eine HIV-Infektion im Mausmodell zu imitieren. Eine intranasale Infektion mit EHV-L-luc-gag von Balb/c Mäusen, die zuvor mit hoch attenuierten rekombinanten pockenviralen Vektoren (NYVAC-gag) immunisiert worden waren, zeigte im Vergleich mit nicht-immunisierten Mäusen, dass die intranasale Immunisierung mit NYVAC-Vektoren einen Schutz vor der EHV-L-luc-gag Infektion induzierte, wohingegen eine intramuskuläre Immunisierung das Immunsystem der Balb/c Mäuse sogar negativ beeinflusste. Diese Effekte wurden jedoch nicht nur durch das Gag-Antigen verursacht, sondern wurden vor allem durch die NYVAC-Vektoren selbst hervorgerufen.

The application of viral vector systems as recombinant vaccines is limited by numerous factors such as (1) preexisting vector immunity, (2) low immunogenic potential or (3) highly restricted packaging capacity for extrinsic antigens. Equine herpes virus type 1 (EHV-1), which is apathogenic for humans, represents a new promising viral vector, because all previous data showed that there is no preexisting immunity against EHV-1. Furthermore evaluation of the immunogenic potential of EHV-1 vectors revealed transgene-specific cellular as well as humoral immune responses in Balb/c mice. In addition, transgene-specific mucosal immune responses could also be induced by a heterologous prime/boost regime consisting of a DNA-prime and a twofold intranasal EHV-1 vector boost. These responses play a major role for the efficiency of HIV vaccines since the mucosa is the major entry site for HIV. In this thesis, three differentially attenuated EHV-1vector variants were analyzed: (1) the pathogenic RacL strain, which causes respiratory diseases and aborts in horses, (2) the RacH strain, which was attenuated by 256-fold passaging of RacL on porcine kidney cells and (3) a virus based on RacH with a specific deletion of the UL-48 gene by RED-recombination. UL48 codes for the protein eTIF (equine trans-inducing factor), which acts as a transactivator and induces the expression of the only immediate early protein of EHV-1, and consequently initiates the process of replication. Therefore EHV ΔUL48 vectors are strongly restricted in replication, but can be propagated to high titers in a trans-complementing cell line (RK13-48). Different transgenes were inserted into the gradually attenuated vector variants. These vectors were analyzed for safety and their immunogenic potential. The safety aspect was assessed by vector-viral pathogenic characteristics and by biodistribution analysis of luciferase-coding EHV-1 (EHV-luc) in the mouse model. EHV-luc and EHV-luc-ΔUL48 based on RacH turned out to be apathogenic after intranasal application to Balb/c mice, whereas EHV-L-luc, based on RacL caused reversible clinical symptoms like body weight loss. The analysis of the biodistribution by in vivo imaging and quantitative real-time PCR demonstrated that - depending on the application route (intranasal vs. intramuscular) - the vectors are restricted to corresponding tissues and compartments, and that there is no uncontrolled distribution in the body of the mouse. Thereby EHV-luc showed the strongest transgene expression as well as the highest amounts of genome equivalents in murine tissues. To investigate the immunogenic potential of EHV-1 vectors, immunization studies were conducted with vectors coding for the HIV-1 envelope protein gp120. EHV-gp120 as well as EHV-gp120 ΔUL48 induced gp120-specific cellular and humoral immune responses after intranasal application. Furthermore a heterologous prime/boost strategy with a DNA-prime and a twofold intranasal EHV-1-boost induced gp120-specific mucosal humoral immune responses. The immunogenic potential of EHV-gp120-ΔUL48 was clearly decreased compared to EHV-gp120 confirming data from previous immunization studies with HIV-gag as a reporter construct. EHV-1 vectors are able to transduce in vitro generated human dendritic cells and induce their maturation. In this work it could be shown that EHV-1 vectors transduce monocytes and macrophages, as well as B-cells and induce the expression of the transgene. This is promising with regard to the application of EHV-1 based recombinant vaccines in humans. Moreover EHV-1 vectors can be used in place of cost-intensive peptides for restimulation of T-cells in ex vivo assays. To assess the success of vaccination in an in vivo challenge model, an HIV-1 gag gene was inserted into a pathogenic EHV-L-luc vector to mimic an HIV infection in the mouse model. An intranasal infection with EHV-L-luc-gag of Balb/c mice, previously immunized with attenuated recombinant poxviral vectors (NYVAC-gag), revealed that compared to non-immunized mice intranasal immunization with NYVAC-gag induces protection against EHV-L-luc-gag infection, whereas an intramuscular immunization with NYVAC-gag even has a negative impact on the immune response of Balb/c mice. Interestingly, these effects were not only caused by the gag antigen but primarily by the NYVAC vector itself.