Glycolipid-Engineering zur Aufklärung der biologischen Funktion von Sterylglycosiden in der Pexophagie von Pichia pastoris

Abstract

Sterylglycoside sind Membranlipide, die in vielen Eukaryoten und einigen Prokaryoten vorkommen. Durch die Aktivität von Sterol-Glycosyltransferasen werden diese Glycolipide aus einem Sterolmolekül und einem UDP-Zucker synthetisiert. Über die biologischen Funktionen dieser Membranlipide ist bislang nur wenig bekannt. Studien wiesen der Ergosterol-Glucosyltransferase UGT51B1 eine Rolle beim Abbau von Peroxisomen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris zu. Der Abbau der Peroxisomen ist ein Autophagie-Prozess. Autophagie-Prozesse sind zelluläre, degradative Prozesse, welche konserviert in Eukaryoten vorliegen und nach Änderungen der Umweltbedingungen ausgeführt werden. Steht der Hefe als Kohlenstoffquelle Methanol zur Verfügung, erzeugt diese viele, große Peroxisomen, die für den Katabolismus des Methanols das Enzym Alkoholoxidase beinhalten. Nach einem Wechsel der Kohlenstoffquelle von Methanol zu Glucose sammeln sich die Peroxisomen nahe der Vakuolenmembran, werden von dieser umhüllt und anschließend durch vakuoläre, hydrolytische Enzyme degradiert. In die Elongation der Vakuolenmembran ist ein Autophagie-spezifisches Membransystem involviert. In dieser Arbeit sollten die biologischen Funktionen von Sterylglycosiden untersucht werden. Es sollte geklärt werden, ob Ergosteryl-beta-Glucosid für den Peroxisomenabbau essentiell ist. Oder ob das Protein UGT51B1 unabhängig von seiner enzymatischen Aktivität am Peroxisomenabbau beteiligt ist. Dazu wurden mittels gezielter Mutagenese Nukleotide in Ugt51B1 ausgetauscht. Dies führte wiederum zu Aminosäureaustauschen in konservierten Bereichen der katalytischen Domäne des Proteins. So konnten UGT51B1-Varianten generiert werden, die zwar kein Ergosteryl-beta-Glucosid mehr synthetisieren konnten, aber in ihrer Proteinfaltung nicht beeinträchtigt sein sollten. Nach Expression dieser modifizierten Proteine in P. pastoris boten die in der Sterylglycosid-Synthese beeinträchtigten Hefen nun die Möglichkeit, das Protein UGT51B1 unabhängig von seiner Enzymaktivität zu analysieren. Frühere Studien belegten, dass UGT51B1 an einen inaktiven Vorläufer des Autophagie-spezifischen Membransystems rekrutiert wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch UGT51B1-Aktivität synthetisiertes Ergosteryl-beta-Glucosid für die Differenzierung des funktionalen Membransystems unentbehrlich ist. Die Funktionalität dieses Membransystems ist wiederum essentiell für den Peroxisomenabbau. Nachdem erste Untersuchungen auf eine Bedeutung des Ergosteryl-beta-Glucosids im Peroxisomenabbau hinwiesen, sollte festgestellt werden, ob das Sterylglycosid für die Erfüllung der Funktion im Abbauprozess strukturelle Voraussetzungen erfüllen muss. Dazu sollten weitere P. pastoris-Transformanten erzeugt werden, die in der Lage waren, strukturell modifizierte Sterylglycoside in einer UGT51B1-defizienten Mutante zu synthetisieren. Dies konnte durch das Anwenden der Glycolipid-Engineering-Methode erreicht werden. Bei dieser werden Sterylglycoside nicht nur wie bei Erzeugung einer Gen-Deletionsmutante entfernt, sondern gegen strukturell modifizierte Sterylglycoside ausgetauscht. Dazu sollten heterologe Steryl-Glycosyltransferasen mit veränderter Spezifität in P. pastoris exprimiert werden. Durch Gegenüberstellung der Phänotypen der Wildtyp-Hefe und der transgenen Hefen war es anschließend möglich, die Funktionen der nativen Sterylglycoside zu identifizieren, welche von heterologen Sterylglycosiden nicht erfüllt werden konnten. Zu Beginn dieser Arbeit war das Gen für eine Cholesterol-alpha-Glucosyltransferase aus Helicobacter pylori bereits bekannt. Weitere Gene mussten erst identifiziert, kloniert und charakterisiert werden. So wurde das erste Mal eine Cholesterol-beta-Galactosyltransferase aus Borrelia burgdorferi identifiziert. Ebenso konnte das codierende Gen für eine Cholesterol-beta-Glucosyltransferase aus B. hermsii ermittelt werden. Somit konnte auch eine bakterielle Variante von UGT51B1 identifiziert werden. Anschließend konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit transgene Hefen analysiert werden, die Ergosteryl-beta-Galactosid und Ergosteryl-alpha-Glucosid synthetisieren konnten. Als Kontrolle wurde zudem eine Hefe generiert, welche Ergosteryl-beta-Glucosid durch die Aktivität der bakteriellen Sterol-Glycosyltransferase aus B. hermsii synthetisierte. Mit Hilfe dieser Hefetransformanten sollte geklärt werden, ob die strukturellen Sterylglycosid-Varianten die Rolle von Ergosteryl-beta-Glucosid (Synthese katalysiert von UGT51B1) im Peroxisomenabbau übernehmen können. Dazu wurden erste Untersuchungen durchgeführt. Aus den Resultaten ging hervor, dass die Sterylglycosid-Varianten möglicherweise die Funktion des nativen Ergosteryl-beta-Glucosids im Abbau der Peroxisomen ersetzen können.