A comparative testing of Cucumber mosaic virus (CMV)-based constructs to generate virus resistant plants in tobacco species

Abstract

Cucumber mosaic virus (CMV) is an economically important pathogen on chili plants in Asia. So far, no durable resistant chili varieties were available to obtain virus resistant plants through a classical breeding program. Therefore, several biotechnological approaches to generate resistant plants via virus induced gene silencing (VIGS) were tested. However, due to different target plant species, different CMV isolates and different experimental testing systems, an evaluation of the most efficient construct is very difficult from the published data. To evaluate a suitable construct for generating CMV resistance in chilli, several constructs using the regions of the coat protein from RNA 3 and the suppressors of gene silencing expressed from RNA 2 on CMV genome were introduced into two different binary vectors (pLH6000 and pBIN19) as single gene or as an inverted repeat. Additionally, a chimeric construct GFP+2bIR was generated in both binary vectors. These constructs were transformed in two different tobacco species (N. benthamiana and N. tabaccum). The resistance of these transformants was evaluated using different CMV isolates in a standardized testing system. Immunity, tolerance and recovery phenotypes were verified by symptom expression and virus detection by tissue print immunoblots. Resistance screening on F1 generation revealed that resistance variation between gene constructs and tobacco plants: for single gene constructs (△CP, △2a+2b and △2a+△2b in which start codons of CP and 2b genes were deleted) in pLH6000, the given resistance efficiency rank was pLH6000-△2a+2b > pLH6000-△2a+△2b > pLH6000-△CP in N. benthamiana, while the given rank was not clear in N. tabaccum; however, the given resistance efficiency rank of single gene constructs in pBIN19 was not clear in both tobacco plants because of a lower resistant efficiency. For 2bIR construct, the resistant efficiency in N. benthamiana was higher than in N. tabaccum, and therefore the given rank was pLH6000-2bIR > pBIN19-2bIR in N. benthamiana but not in N. tabaccum. For CPIR, the resistance variation was not clear in both tobacco plants when challenged with heterologous isolate CMVAN. For GFP+2bIR, resistance efficiency was obviously enhanced in both tobacco species with exception of N. benthamiana in pLH6000-GFP+2bIR, all resistant plants were further verified to be immune to CMV-AN by symptom expression, tissue print immunoblot and back inoculation. In addition, three transgenic N. benthamiana lines from pBIN19-2bIR (one line) and pBIN19-GFP+2bIR (two lines) were further challenged with five different CMV isolates. These three lines exhibited broad-resistance against five different CMV isolates. Taken together, (I) the resistance efficiency in tobacco species was ranged from 0 to 100%, which is independent of vectors and/or plant species. (II) Resistance using RNA 3 fragments is lower than with RNA 2 fragments. (III) A chimeric construct with nontarget DNA as flanking sequence showed higher resistant efficiency even when these lines were challenged with heterologous CMV isolates when compared with 2bIR constructs. However the construct should be optimized by exchanging the GFP with a viral sequence before using it to obtain resistant vegetable against CMV in Asian agriculture.

Cucumber mosaic virus (CMV) verursacht in Asien bedeutende ökonomische Schäden an Chilli. Bis heute sind keine Chilli-Varietäten bekannt, die eine dauerhafte Resistenz über klassische Züchtungsprogramme ermöglichen. Aus diesem Grund wurden verschiedene gentechnologische Ansätze für eine virusinduzierte Resistenz (virus induced gene silencing, VIGS) getestet. In verschiedenen Publikationen wurden unterschiedliche Wirtspflanzen, unterschiedliche CMV-solate und verschiedene Testsysteme verwendet, deswegen ist eine Evaluierung des besten Konstruktes auf der Basis von publizierten Daten sehr schwierig. Zur Bestimmung eines geeigneten Konstruktes zur Generierung von CMV-resistentem Chilli wurden verschiedene Bereiche des Hüllproteins der RNA 3 und des gene silencing suppressors der RNA 2 des CMV-Genoms in zwei unterschiedliche binäre Vektoren (pBIN 19 und pLH 6000) als „single gene“ oder als „inverted repeat“ Konstrukt kloniert. Zusätzlich wurde ein chimäres Konstrukt (GFP-2b IR) in beide Vektoren kloniert. Beide Konstrukte wurden jeweils in zwei Tabakarten (Nicotiana benthamiana und Nicotiana tabaccum) stabil transformiert. Die Resistenz dieser Isolate wurde mit verschiedenen CMV-Isolaten in einem standardisierten Testsystem evaluiert. Die Phänotypen Immunität, Toleranz und Erholung wurde anhand von Symptomausprägung und Virusnachweis in Gewebeabdrücken mit Hilfe von serologischer Detektion beobachtet. Die Resistenztestung der F1 Generation zeigte eine Variation der Resistenz abhängig vom Genkonstrukt und der Wirtspflanze: Für die „single gene“ Konstrukte ΔCP, Δ2a+2b und Δ2a+ Δ2b (in denen das Startkodon von CP bzw. 2b entfernt wurde) im binären Vektor pLH6000 zeigte die Reihenfolge pLH6000- Δ2a+2b > pLH6000- Δ2a+ Δ2b > pLH6000- ΔCP in N. benthamiana, während in transformierten N. tabaccum die Reihenfolge unklar war. Die Rangfolge in beiden Pflanzenspezies war unklar, wenn mit dem binären Vektor pBIN19 transformiert wurde, da hier generell eine geringe Resistenz beobachtet wurde. Die Resistenz für das 2bIR Konstrukt war in N. benthamiana höher als in N. tabaccum und folglich war die Güte der Resistenz in der Reihenfolge pLH6000-2bIR > pBIN19-2bIR in N. benthamiana aber nicht in N. tabaccum. Für das Konstrukt CPIR folgte die Resistenz keiner erkennbaren Regel in beiden Wirtspflanzen für den Fall, dass mit dem heterologen Isolat CMVAN infiziert wurde. Bei Pflanzen, die mit dem Konstrukt GFP+2bIR transformiert waren, war eine signifikant bessere Resistenz in beiden Wirtspflanzen zu beobachten, allerdings mit der Ausnahme von N. benthamiana transformiert mit dem Konstrukt pLH6000-GFP2bIR. Die Abwesenheit von Virus wurde bei als immun bewerteten Pflanzen mit Gewebeabdrücken und serologischer Detektion sowie Biotests bestätigt. Zusätzlich zur Testung mit dem homologen Isolat wurden drei Linien (1 x pBIN19-2bIR und 2 x pBIN19-GFP+2bIR) mit weiteren Isolaten auf Resistenz überprüft. Alle drei Linien zeigten eine breite Resistenz gegenüber fünf verschiedenen CMV-Isolaten. Zusammengefasst ergab sich Folgendes: (I) die Reistenzgüte in den beiden transformierten Tabakarten variierte von 0 bis 100 %, unabhängig vom Vektor und Pflanzenart. (II) Die Resistenz, die mit Fragmenten der RNA 3 erhalten wurde, war niedriger als diejenige, die mit Fragmenten der RNA 2 erhalten wurde. (III) Ein chimäres Konstrukt mit einer virusunabhängigen DNA als flankierende Sequenz zeigte eine bessere Resistenz als 2bIR-Konstrukte, und zwar sogar dann, wenn mit nicht-homologen Isolaten getestet wurde. Trotzdem sollte dieses chimäre Konstrukt optimiert werden, indem das GFP gegen virale Sequenzen ausgetauscht wird, bevor es zum Einsatz zur Erzeugung von CMV-resistentem Gemüse in Asien kommt.