Characterization of the envelope-mediated steps in the life cycle of hepatitis B viruses

Abstract

Die Bildung von membranumhüllten Viren erfolgt an zellulären Membranen. Über die späten Schritte des Replikationszyklus der Hepatitis B-Viren (HBV) ist wenig bekannt. Zu diesen gehören der virale Zusammenbau („assembly“), die Knospung („budding“), der intrazelluläre Transport und die Freisetzung der Nachkommensviren. Das Hauptziel der Dissertationsarbeit war, die zellulären Strukturen, an denen die Morphogenese von HBV erfolgt, am Modell des Enten-Hepatitis B-Virus (DHBV) ultrastrukturell, biochemisch, und zellbiologisch zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass es im Verlauf einer hepadnaviralen Infektion zu einer massiven Umstrukturierung des Endomembransystems der Hepatozyten kam. Diese äußerte sich in der Umorganisation des rauhen endoplasmatischen Retikulums (rER) und der Bildung zahlreicher intrazellulärer, Virus-enthaltender Vesikel (VCVs) unterschiedlicher Größe. Ein Teil der VCVs leitete sich wahrscheinlich von der äußeren Kernmembran und dem rER ab. In dieser Arbeit konnte erstmals die offene Frage beantwortet werden, ob die für Hepatitis B-Viren typischen subviralen Partikel (SVPs) und Virionen über denselben Morphogeneseweg gebildet werden. Zum ersten Mal wurden frühe und späte Stadien der viralen Knospung an Endomembranen und VCVs abgebildet. Die weiteren ultrastrukturellen Untersuchungen von primären Entenhepatozyten-Kulturen (PDHs), Enten-Leberbiopsien und der DHBV-replizierenden Hühner-Hepatom-Zelllinie D2 zeigten, dass die Morphogenese von DHBV in vivo und in vitro konserviert ist. Subzelluläre Fraktionierung von DHBV-infizierten Lebern durch Dichtegradienten-Zentrifugation ergab eine gute Auftrennung von ER und Golgi und zeigte, dass die viralen Partikel in ER-Fraktionen angereichert und nicht in Golgi-Fraktionen vorhanden waren. Diese Befunde wurden durch Immunisolierung der VCVs mittels L-Antiserum aus Zellhomogenaten bestätigt. Die anschließende biochemische Analyse der Immunpräzipitate zeigte die Anreicherung der ER-Markerproteine Calnexin und MTP (microsomal triglyceride transfer protein), Membrin, ein Marker für das „ER to Golgi intermediate compartment“ (IC), und Rab5B, ein Marker für frühe Endosomen, an den VCVs. EEA1 („early endosomal antigen 1“), ein Adaptorprotein an frühen Endosomen, war jedoch nicht in VCVs nachzuweisen. Dies deutete auf eine spezifische Rekrutierung und daher besondere Rolle von Rab5B an VCVs hin. Diese Befunde wurden durch Immunfluoreszenzuntersuchungen bestätigt. Diese zeigten deutlich, dass VCVs keine Markerproteine von späten oder von „recycling“ Endosomen enthielten. Weiterhin konnte ausgeschlossen werden, dass es sich bei VCVs um sogenannte „multivesicular bodies“ (MVBs) handelte, obwohl in der Immunfluoreszenzfärbung eine partielle Überlappung der VCVs mit CD-63, einem Marker für MVBs, zu beobachten war. VCVs sind Virus-induzierte, neue Membranstrukturen mit einzigartiger Identität. Sie enthalten Markerproteine von ER, IC, frühen Endosomen und MVBs. Es sind dynamische Strukturen, deren Form und Größe sowohl durch Fusion als auch Abschnürung reguliert wird, wie mittels Elektronenmikroskopie und Lebendzelldarstellung gezeigt werden konnte. Der intrazelluläre Transport dieser VCVs benötigte intakte, aber keine dynamischen Mikrotubuli, wobei das Aktinzytoskelett entbehrlich war. Die Freisetzung der Nachkommensviren war weitgehend Golgi-unabhängig und erfolgte über einen alternativen exozytischen Prozess. Ultrastrukturell konnten erstmals das Andocken der VCVs an die Plasmamembran und exozytische Freisetzung des viralen Inhaltes sichtbar gemacht werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass während der Exozytose die in der Vesikelmembran enthaltenen, noch nicht partikularisierten, viralen Hüllproteine an die Zellmembran transferiert wurden. Die Bestimmung der viralen Ausschleusungskinetik ergab, dass jede einzelne Zelle etwa 40 bis 80 Virionen und etwa 46.000 SVP in einer Stunde freisetzte. Durch Brefeldin A-Behandlung (BFA) konnte die Sekretion der viralen Partikel stark und reversibel gehemmt werden. Dieser Sekretionsblock führte zur Akkumulation von viralen Partikeln in VCVs, die 4-5-fach größer waren, als die VCVs in unbehandelten Zellen. Zusätzlich wurde die Rolle der so genannten „lipid rafts“ in der viralen Morphogenese durch pharmakologische Interferenzstudien untersucht. Die Studien zeigten, dass die Zerstörung der „lipid rafts“ die Bildung und Sekretion der Nachkommensviren nicht beeinflusste und diese somit keine Plattform für Zusammenbau, Knospung und Freisetzung der Nachkommensviren darstellten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse meiner Dissertationsarbeit, dass die Reorganisation der Endomembranen im Laufe einer DHBV-Infektion zur Bildung neuer Membrankompartimente führt, die als eine zentrale Plattform für den viralen Zusammenbau, Knospung, intrazellulären Transport und die Sekretion dieser Viren fungieren.

Formation of enveloped viruses involves assembly and budding at cellular membranes. Little is known about the late steps of hepatitis B viruses (HBV) infection including assembly, budding, intracellular transport, and secretion of progeny virus. The aim of this work was to identify and characterize the hepatocellular compartments and pathways exploited during virus morphogenesis using the duck hepatitis B virus (DHBV) and primary duck hepatocytes (PDHs) as a model system. Ultrastructural analysis showed that the formation of virus progeny initiates at the endoplasmic reticulum (ER) and proceeds via membrane-surrounded vesicles which contain viral particles (virus particles-containing vesicles, VCVs). These VCVs were generated and maintained by reorganization of endomembranes accompanied by a striking disorganisation of the rough ER. VCVs contained both virions and subviral particles (SVPs), indicating a common morphogenetic pathway for both viral particle entities. For the first time, ultrustructural evidence for the early and late features of the budding of both particle types at endomembranes and VCVs was provided. Ultrastructural analysis of DHBV-infected PDH cultures, liver biopsies and the DHBV-transfected chicken hepatoma cell line D2 revealed that DHBV morphogenesis is conserved both in vitro and in vivo. Subcellular fractionation of DHBV-infected liver based on iodixanol gradient centrifugation resulted in clear separation of ER from Golgi and showed enrichment of viral particles in ER fractions and their exclusion from Golgi fractions. Native VCVs were immunocaptured from dounce homogenates using L-antiserum as shown by ultrastructural analysis. Biochemical analysis of immunoprecipitates revealed that VCVs contain ER marker proteins such as calnexin and microsomal triglyceride transfer protein (MTP), membrin, a marker for the ER-to-Golgi intermediate compartment (IC), and Rab5B, an early endosome marker. However, the early endosomal antigen 1 (EEA1), another adaptor protein of early endosomes, was excluded from VCV-membranes, indicating a specific recruitment and role for Rab5 during viral morphogenesis. These findings were confirmed and extended by colocalization studies using a large panel of antibodies against subcellular markers. Overall, these studies showed that VCVs were distinct from late and recycling endosomes. Although part of the VCVs harboured CD63, a tetraspanine protein characteristic for multivesicular bodies (MVBs), they were distinct from these since no overlap with Tsg101, which functions in vacuolar protein sorting, was observed. VCVs were identified as novel organelles with mixed identity and harboured markers of ER, IC, endosomes, and MVBs. VCVs are dynamic structures and their size and shape are regulated by both fusion and fission as revealed by electron microscopy and life cell imaging. The intracellular transport of these VCVs required intact but not dynamic microtubules, while actin filaments were dispensable. Virus secretion was mainly Golgi-independent and mediated by an exocytic release mechanism. Docking and fusion of VCVs with the plasma membrane (PM) led to liberation of about 40-80 virions and 46,000 SVPs per hepatocyte and per hour. Pharmacological interference studies with brefeldin A (BFA), which blocks protein export from the ER and causes disruption of the Golgi complex and subsequent fusion with the ER, resulted in strong, virtually complete inhibition of viral secretion. Under treatment, intracellular viral particles accumulated in large cytoplasmic membrane tubules and these vesicles were 4-5-fold as large as VCVs in non-treated cells. The effects of BFA were presumably due to homotypic fusion of VCVs and to inhibition of exocytosis by blocking the fusion of VCVs with the PM. Moreover, the role of cholesterol and lipid rafts in viral morphogenesis was investigated by pharmacological interference studies. The results showed that disruption of lipid rafts did not interfere with the formation and secretion of progeny virus. These findings indicated that lipid rafts do not serve as platforms for DHBV assembly, budding, and secretion. In conclusion, the data obtained offer new insights into the still incomplete “morphogenetic puzzle” of hepadnaviruses. This includes reorganisation of endomembranes during DHBV infection and the biogenesis of novel cellular vesicles which serve as multifunctional platforms for assembly, budding, intracellular transport, and secretion of progeny virus.