Monitoring of real time cGMP dynamics in hypoxic injury and atrial fibrillation to better understand and treat cardiovascular disease

Abstract

The development of new cardioprotective strategies to treat cardiovascular diseases (CVDs) is the major goal of cardiovascular research. The second messenger 3’,5’-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) is known for its cardioprotective role in the cardiovascular system. In this work, the cardioprotective role of cGMP was investigated in two common CVD conditions, hypoxia/reoxygenation injury and atrial fibrillation (AF). Hypoxia/reoxygenation injury is considered as one major characteristic of many CVDs. However, little is known about the role of cGMP dynamics during hypoxia/reoxygenation. In this part of the work, Förster resonance energy transfer (FRET)-based cGMP measurements were used in order to analyse real time cGMP dynamics during hypoxia/reoxygenation. Hypoxia/reoxygenation injury caused a significant increase in basal cGMP levels in adult ventricular mouse cardiomyocytes. This was due to protein instability of phosphodiesterase 3A (PDE3A), which led to a reduction of cGMP degradation. Furthermore, the redox equilibrium of the nitric oxide (NO)-stimulated guanylyl cyclase (NO-GC), which is responsible for basal cGMP production, was shifted towards the oxidized, NO-insensitive form. These basic findings from an in vitro model of hypoxic injury could be validated in an ex vivo whole heart Langendorff model of anoxic injury as well as in an in vivo open chest model of ischemia/reperfusion injury, which demonstrates the physiological relevance of the results. FRET-based cGMP measurements in human ventricular cardiomyocytes made it possible to show the reproducibility of these findings in the human situation. This shows the potential of using the cGMP signalling cascade as a therapeutic target in the treatment of hypoxia/reoxygenation injury in the clinics. Currently available treatment options for AF are limited and new molecular targets are urgently needed. In this part of the work, FRET-based cGMP imaging was used in human atrial cardiomyocytes of right (RA) and left atria (LA) of patients in sinus rhythm (SR) and with AF in order to figure out whether the cGMP signalling cascade could be a potential therapeutic target for the treatment of AF. The data demonstrate that both, NO-GC and natriuretic-peptide-stimulated GC (NP-GC) are involved in cGMP generation in human atrial cardiomyocytes. However, whereas the cGMP increase upon NO-GC stimulation was equal in cardiomyocytes of RA and LA of patients in SR and with AF, the cGMP increase upon NP-GC stimulation was different. Furthermore, it could be shown that PDE1, PDE2, PDE3, and PDE5 are involved in cGMP degradation. Whereas inhibition of PDE3 increased cGMP levels equally in all conditions, the effects of PDE2 and PDE5 inhibition were different. The data provide fundamental insights into the regulation of the cGMP signalling cascade in human atrial cardiomyocytes under healthy and disease conditions and demonstrate the potential of the cGMP signalling cascade as a therapeutic target in the treatment of AF.

Die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten für Herz-Kreislauf-Erkrankungen ist das Hauptziel der kardiovaskulären Forschung. 3’,5’-Cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) ist ein Second Messenger, der für seine kardioprotektive Funktion im Herz-Kreislauf-System bekannt ist. In dieser Arbeit wurde die Rolle von cGMP in zwei häufig vorkommenden Herz-Kreislauf-Erkrankungen untersucht, Hypoxie/Reoxygenierung und Vorhofflimmern. Ein Hauptmerkmal vieler Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind Verletzungen durch Hypoxie/Reoxygenierung. Über die Rolle von cGMP während Hypoxie/Reoxygenierung ist bisher allerding nur wenig bekannt. In diesem Teil der Arbeit wurden Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-basierte cGMP Messungen verwendet, um die cGMP Signalkaskade während Hypoxie/Reoxygenierung zu analysieren. Hypoxie/Reoxygenierung in adulten ventrikulären Maus Kardiomyozyten führte zu einem Anstieg der basalen cGMP Spiegel. Dieser Anstieg wurde durch Protein-Instabilität der Phosphodiesterase 3A (PDE3A) verursacht, was zu einer Reduzierung des cGMP-Abbaus führte. Darüber hinaus wurde das Redoxgleichgewicht der für die basale cGMP Produktion verantwortlichen Stickstoffmonoxid (NO) stimulierten Guanylatcyclase (NO-GC) in Richtung der oxidierten, NO-unsensitiven Form verschoben. Diese grundlegenden Befunde aus einem In-vitro Hypoxie/Reoxygenierung-Modell konnten in einem Ex-vivo Ganzherz-Langendorff-Anoxie-Modell sowie in einem In-vivo Ischämie/Reperfusion-Modell validiert werden. cGMP Messungen in humanen ventrikulären Kardiomyozyten zeigten die Reproduzierbarkeit dieser Befunde im Menschen. Dies macht das Potenzial der cGMP Signalkaskade als Angriffspunkt für die Behandlung von Verletzungen durch Hypoxie/Reoxygenierung in der Klinik deutlich. Da die verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten bei Vorhofflimmern sehr begrenzt sind, ist die Entwicklung neuer molekularer Ziele dringend erforderlich. In diesem Teil der Arbeit wurden FRET-basierte cGMP Messungen in humanen Kardiomyozyten aus linken und rechten Vorhöfen von Patienten im Sinus Rhythmus oder mit Vorhofflimmern verwendet, um herauszufinden, ob die cGMP Signalkaskade ein potenzielles therapeutisches Ziel für die Behandlung von Vorhofflimmern darstellt. Sowohl NO-GC als auch die von natriuretischen Peptiden stimulierte Guanylatcyclase (NP-GC) sind an der cGMP Synthese beteiligt. Während NO-GC Stimulation zu einem identischen cGMP Anstieg in Kardiomyozyten aus allen Bedingungen führte, war er nach NP-GC Stimulation unterschiedlich. PDE1, PDE2, PDE3 und PDE5 sind am Abbau von cGMP in atrialen Kardiomyozyten beteiligt. Während der cGMP Anstieg nach PDE3 Inhibition in allen Bedingungen gleich war, hatte die Inhibition von PDE2 und PDE5 unterschiedliche Auswirkungen. Die Daten liefern grundlegende Einblicke in die Regulation der cGMP-Signalkaskade in atrialen Kardiomyozyten sowohl unter gesunden als auch unter Krankheitsbedingungen. Sie machen das Potenzial der cGMP Signalkaskade als therapeutisches Ziel bei der Behandlung von Vorhofflimmern deutlich.