Molekulare Mechanismen der NET Bildung in vivo

Abstract

Entzündungsprozesse dienen als Schutzmechanismus vor pathogenen Mikroorganismen und Gewebeschäden. Eine anhaltende Entzündung kann pathologische Auswirkungen haben. Während einer Entzündung sind Neutrophile der vorherrschende Zelltyp. Neutrophile eliminieren Mikroorganismen und Gewebeschäden am Entzündungsherd mithilfe von zellulären Mechanismen wie Phagozytose, Degranulation oder der Bildung von Neutrophil Extracellular Traps (NETs). NETs bestehen aus langen DNA Strängen, die mit toxischen Proteinen dekoriert sind. NETs spielen eine wichtige Rolle in der Wirtsabwehr, allerdings kann ein unvollständiger Abbau oder eine unangemessene Freisetzung eine Reihe von zytotoxischen, pro-inflammatorischen und pro-thrombotischen Prozessen auslösen. Obwohl NETs an der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt sind, existieren wenige NET-spezifische Targets. Die molekularen Signalwege der NETose sind weitestgehend unerforscht, was sich vor allem auf den Mangel von geeigneten präklinischen Tiermodellen zurückführen lässt. In Labormäusen sind Neutrophile nicht häufig, was das Detektieren von NETs in vivo erheblich erschwert. Der Labormausstamm C57BL/6 hat 10-25% Neutrophile im Blut, demgegenüber hat der Mensch 50-70% Neutrophile in der Blutzirkulation. In dieser Arbeit konnten wir ein chronisches Neutrophilie Modell in Labormäusen etablieren. Mithilfe eines Leberspezifischen Expressionsvektors war es uns möglich den Granulocyte Colony Stimulating Factor (GCS-F), ein Cytokin das die Bildung von Granulozyten anregt, stabil zu exprimieren. Darüber hinaus konnten wir zwei DNA-abbauende Enzyme finden, DNASE1 und DNASE1-LIKE 3 (DNASE1L3), die NETs in der Blutzirkulation abbauen können. Zudem konnten wir feststellen, dass die Doppel-Knockout-Linie, Dnase1-/-Dnase1l3-/- nach G-CSF-gesteuerter Neutrophilie und Sepsis, vaskuläre NET-Okklusionen bildete. NET-Okklusionen behindern den Blutfluss, verursachen Gewebeschäden und können zum Tod führen. Folglich konnten wir ein Mausmodell etablieren, das eine direkte Verbindung zwischen NETs und Pathogenese zeigt. Anschließend konnten wir mithilfe des Mausmodells zur weiteren Erforschung der molekularen Signalwege bei der intravaskulären NETose beitragen. NETose wird durch Peptidyl Arginine Deiminase 4 (PAD4), NADPH Oxidase (Nox2), Gasdermin D (GSDMD) und Myeloid Differentiation Primary Response 88 (MyD88) reguliert. Wir testeten daraufhin den Einfluss dieser Proteine in der intravaskulären NETose, indem wir chronische Neutrophilie und Sepsis in den folgenden Dreifach-Knockout (K.O.) Mäusen auslösten: Dnase1-/-Dnase1l3-/- Pad4-/-, Dnase1-/-Dnase1l3-/- Nox2-/-, Dnase1-/-Dnase1l3-/- Gsdmd-/-, Dnase1-/-Dnase1l3-/- Myd88-/-. Die Dreifach-K.O. Mäuse bildeten intravaskuläre NET Aggregate nach der G-CSF induzierten Neutrophilie infolge derer sie verstarben. Im Gegensatz dazu, überlebten die Dnase1-/-Dnase1l3-/-Myd88-/- die ausgelöste Sepsis. Wir konnten zeigen, dass die intravaskuläre NETose während einer Sepsis MyD88 abhängig ist und dass Neutrophile unter sterilen oder infektiösen Konditionen unterschiedliche Signalwege nutzen. Des Weiteren konnten wir einen Subtyp von Neutrophilen, bekannt als „low density neutrophils“ (LDN), beschreiben, der in den G-CSF Mäusen deutlich erhöht war. Zusammenfassend kann man sagen, dass G-CSF NETose vermutlich über einen nicht-kanonischen Signalweg mit Beteiligung von LDNs auslöst. Letztlich konnten wir eine spezifische Methode etablieren, um NETs in vivo unter Zuhilfenahme eines synthetischen Thymidin-Analogons, 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU), nachzuweisen. Mit BrdU markierte Neutrophile dienen als Werkzeug, um die Bildung und Ablagerung von NETs in unterschiedlichen Krankheitsmodellen darzustellen.

Inflammation is a protective response to microbial invasion and tissue injury. Persistent inflammation is pathological. Neutrophils are the predominant cell types of inflammation. At the site of injury, neutrophils eliminate microbes and damaged tissue by phagocytosis, degranulation or by neutrophil extracellular traps (NETs) formation. NETs are lattices of DNA-filaments decorated with toxic protein. NETs are important for host defence, but improper NETs clearance is harmful due to their cytotoxic, pro-inflammatory and pro-thrombotic properties. Although NETs are implicated in a number of diseases, therapeutic targets to treat NETs are not well established. Due to the lack of robust in vivo NETs model, the molecular pathways involved in NETosis is poorly understood. The detection of NETs in vivo has been challenging due to the low abundance of neutrophils in mice. Standard laboratory mice (C57BL/6) contain only 10–25% neutrophils in circulation, in contrast to humans, who have 50–70% neutrophils in circulation. In this thesis, we developed a murine neutrophilia model by the stable hepatic expression of granulocyte colony stimulating (G-CSF), a cytokine that stimulates neutrophil production in recipient mice. Furthermore, we observed that two DNA-degrading enzymes, DNASE1 and DNASE1-LIKE 3 (DNASE1L3), degrade NETs in circulation. Importantly, Dnase1-/-Dnase1l3-/- develop vascular clots of NETs during G-CSF driven neutrophilia and sepsis. NET clots obstructed blood flow and cause organ damage and death. Thus, this mouse model provides direct link between NETs and disease. Next, we used this mouse model as a tool to study the molecular mechanism of intravascular NETosis. NET formation is regulated by peptidyl arginine deiminase 4 (PAD4), NADPH oxidase (Nox2), gasdermin d (GSDMD) and myeloid differentiation primary response 88 (MyD88). We tested the role of these proteins in intravascular NETosis by inducing chronic neutrophilia and sepsis in triple knock out mice i.e. Dnase1-/-Dnase1l3-/- Pad4-/-, Dnase1-/-Dnase1l3-/- Nox2-/-, Dnase1-/-Dnase1l3-/- Gsdmd-/-, Dnase1-/-Dnase1l3-/- Myd88-/-. The triple knock out mice were not protected from death due to intravascular NET clots during G-CSF induced neutrophilia. In contrast to this, Dnase1-/-Dnase1l3-/-Myd88-/- mice, survived sepsis. We confirm that intravascular NETosis in sepsis is a MyD88 mediated signalling pathway and that neutrophils engage different pathways of NETosis under sterile and infectious conditions. Furthermore we found that a subset of neutrophils, known as low density neutrophils (LDNs), were highly enriched in the G-CSF treated mice. In conclusion, G-CSF may induce NETosis via a non-canonical pathway involving LDNs. Finally, we established a specific method to track NETs in vivo using 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) a synthetic analogue of thymidine. BrdU labelled neutrophils provide a tool to explicitly study the formation and deposition of NETs in different diseases models.