The Impact of Cryopreservation on CatSper 2 and Tektin 2 in Human Spermatozoa

Abstract

Due to deteriorating quality of spermatozoa after cryopreservation, it became so inevitable to find solutions to maintain its quality so it can fertilize the oocyte. Therefore, the researchers’ focuses was directed toward the genes responsible for the spermatozoa movement and to assess whether or not they are sensitive to the cryopreservation process. CatSper 2 and Tektin 2 are defined as spermatozoa tail proteins which are involved in sperm motility. In fact, cryopreservation is known to cause damage on spermatozoa in many different aspects such as DNA, RNA, motility of spermatozoa and spermatozoa morphology. It was thus hypothesized in this study that CatSper 2 and Tektin 2 are genes responsible for spermatozoa motility and the possibility of being affected during the cryopreservation process is very high, which leads to a decrease in the spermatozoa ability to fertilize the oocyte. So, the purpose of my study was, hence, to investigate the levels of CatSper 2 and Tektin 2 proteins in human spermatozoa samples before and after exposure to liquid nitrogen (LN2) during cryopreservation process. In addition, to assess the CatSper 2 and Tektin 2 mRNA expression before and after cryopreservation stress. Finally, to determine the levels of cryodamage of CatSper 2 and Tektin 2 proteins in human spermatozoa during cryopreservation process in fertile and subfertile males. In total, 48 semen samples were collected and included in this study with a mean age of 36.75 ± 6.25 years. The results showed a decrease in the expression levels of CatSper 2 and Tektin 2 mRNA in the cryopreserved samples compared to the fresh samples, and this downregulation ranged between a fold change of 2.04–11.95 and 1.11–62.68 in the CatSper 2 and Tektin 2 genes, respectively. The differences in expression levels of CatSper 2 and Tektin 2 were significant, with P-values of 0.0039 and 0.0166, respectively, in the cryopreserved samples compared to the fresh samples using RT-qPCR. In addition the levels of the CatSper 2 and Tektin 2 proteins were lower in spermatozoa of cryopreserved samples compared to fresh samples, with 0.44 ± 0.35 vs. 0.77 ± 0.25 (P ≤ 0.0001) and 0.58 ± 0.24 vs. 0.76 ± 0.09 ( P ≤ 0.0001), respectively. On the other hand, these results showed an association between the decrease in the levels of these proteins and fertility status. In conclusion, these findings may be used as markers to explain some of causes related with infertility problems. The findings of my study are remarkable because, according to the available information, this study is considered the first study to evaluate the effects of the cryopreservation process on the CatSper 2 and Tektin 2 mRNA and protein levels in human spermatozoa. Furthermore, the present study points to differences in these two proteins after cryopreservation in fertile and subfertile men.

Um der bei Kryokonservierung auftretenden Qualitätsminderung der Spermatozoen entgegenzuwirken und damit eine Befruchtung der Oozyten zu ermöglichen, ist es notwendig eine Lösung zum Erhalt der Spermatozoenqualität zu finden. Aus diesem Grund beschäftigte sich die bisherige Forschung bereits mit den für die Spermatozoenbewegung verantwortlichen Gene, um zu beurteilen, ob sie vom Prozess der Kryokonservierung beeinflusst werden oder nicht. CatSper 2 und Tektin 2 sind bekannt als Spermatozoen-Schwanzproteine, die an der Spermienmotilität beteiligt sind. Tatsächlich führt die Kryokonservierung der Spermatozoen zu Schäden der DNA, RNA und zu Veränderungen der Motilität und Morphologie der Spermatozoen. Auf Grund dieser Studie wurde daher angenommen, dass CatSper 2 und Tektin 2 als essentielle Gene für die Spermatozoen-Motilität von dem Kryokonservierungsprozess stark betroffen seien. Dies führe zu einer Abnahme der Spermatozoenfähigkeit die Oozyte zu befruchten. Das Ziel meiner Studie war es daher, die Konzentration der Proteine CatSper 2 und Tektin 2 in menschlichen Spermatozoenproben vor und nach der Exposition mit flüssigem Stickstoff (LN2) im Rahmen des Kryokonservierungsprozesses zu untersuchen. Darüber hinaus wurde die mRNA-Expression der genannten Gene vor und nach dem Kryokonservierungsstress ermittelt. Abschließend wurde der während des Kryokonservierungsprozesses entstandene Schaden der CatSper 2- und Tektin 2-Proteine in menschlichen Spermatozoen bei fertilen und subfertilen Männern untersucht. Insgesamt wurden 48 Samenproben von Probanden mit einem mittleren Alter von 36,75 ± 6,25 Jahren gesammelt und in diese Studie aufgenommen. Die Ergebnisse zeigten eine Abnahme des Expressionsniveaus der mRNA der Gene CatSper 2 und Tektin 2 in kryokonservierten Proben im Vergleich zu frischen Proben. Diese Herrunterregulierung lag zwischen einem Faktor von 2,04-11,95 und 1,11-62,68 für die Gene CatSper 2 und Tektin 2. Die Unterschiede in den Expressionsniveaus von CatSper 2 und Tektin 2 konnten signifikant mit P-Werten von 0,0039 bzw. 0,0166 in den kryokonservierten Proben im Vergleich zu den frischen Proben unter Verwendung der RT-qPCR nachgewiesen werden. Das Vorkommen der CatSper 2- und Tektin 2-Proteine war in den frischen Proben im Vergleich zu den kryokonservierten Proben mit 0,44 ± 0,35 vs. 0,77 ± 0,25 (P ≤ 0,0001) und 0,58 ± 0,24 gegenüber 0,76 ± 0,09 (P ≤ 0,0001) niedriger. Abschließend Die Ergebnisse meiner Untersuchungen sind bemerkenswert, weil nach den vorliegenden Informationen die Wirkung des Kryokonservierung-Prozesses auf die CatSper 2 und Tektin 2 mRNA- und Protein-Ebenen in menschlichen Spermien erstmals untersucht wurde. Darüber hinaus zeigt die vorliegende Studie die Unterschiede zwischen diesen beiden Proteinen nach Kryokonservierung in fruchtbaren und subfertilen Männern auf.