Analyse von Wechselwirkungen der Homeodomänen Interagierenden Proteinkinase (Hipk) mit Genen der Augenentwicklung von Drosophila melanogaster

Abstract

Ziel der Arbeit war die Untersuchung des einzigen bei Drosophila vorkommenden Vertreters der HIPK-Familie im Kontext der Augenentwicklung. Die retinale Determination wird bei Drosophila von den Faktoren des Retinalen Determinations Gen Netzwerkes (RDGN) gesteuert. Während einer Interaktionsstudie mit Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) konnten die RDGN-Faktoren Twin of Eyeless (Toy) und Eyeless (Ey) als in vivo Interaktionspartner der Hipk bestätigt werden. Außerdem konnten beide Proteine durch in vitro Phosphorylierungsanalysen als Substrat der Hipk identifiziert werden und die vollständige Kartierung von Toy ergab vier Hipk-Phosphorylierungsstellen. Um die Auswirkungen der Hipk-Phosphorylierung von Toy in vivo zu untersuchen, wurden ausgehend von den kartierten Phosphorylierungsstellen transgene phosphorylierungsmutante Fliegenstämme erzeugt und diese zur ektopischen Expression im Rahmen von Fehlexpressionsanalysen eingesetzt. Zur Auffindung weiterer Wechselwirkungen der Hipk mit Faktoren der Augenentwicklung wurden Kreuzungsanalysen bei variierender Hipk-Dosis durchgeführt. Außerdem konnten bei einer Untersuchung regulatorischer Regionen von hipk drei potentiell augenspezifische hipk-Enhancer identifiziert werden. Zur funktionellen Analyse wurde ein entsprechender transgener Fliegenstamm erzeugt (hipkEGT).

HIPKs are well conserved in different signaling pathways and developmental processes throughout the animal kingdom. Purpose of this work was the investigation of the only representative of the Hipk family in Drosophila within the context of eye development. Retinal determination in Drosophila is molecularly controlled by the Retinal Determination Gene Network (RDGN). Using a Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC), the two RDGN factors and Paired box protein 6 (PAX6) homologues Twin of eyeless (Toy) and Eyeless (Ey) were confirmed to be in vivo interaction partners of Hipk. In addition, Toy and Ey were set in an enzyme-substrate relationship with Hipk by in vitro phosphorylation assays. Full mapping of Toy revealed four Hipk phosphorylation sites. In order to investigate the effects of Hipk phosphorylation in vivo transgenic phosphorylation mutant fly strains were generated based on the mapped Hipk-phosphorylation sites and used for ectopic expression. In order to detect further interactions of the Hipk with factors of eye development, genetic analyzes were performed at varying Hipk dose. In addition, an analysis of hipk regulatory regions by larval reporter gene expression identified three specific hipk enhancers for expression in developing eye tissue. For the functional analysis a corresponding transgenic fly strain was generated (hipkEGT).