Die Nikotinamid Nukleotid Transhydrogenase: Yin Yang der antioxidativen Kapazität in Kardiomyozyten

Abstract

Hintergrund: Oxidativer Stress ist von großer Bedeutung für die Entstehung und Progression einer Herzinsuffizienz und bezeichnet ein Ungleichgewicht zwischen Produktion und Elimination von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Die wichtigsten Quellen von ROS im Herzen sind die NADPH Oxidase (NOX) und Mitochondrien. Die Mechanismen der mitochondrialen ROS-Emission sind unvollständig verstanden. Die Nikotinamid Nukleotid Transhydrogenase (Nnt) katalysiert in Mitochondrien die Reaktion NADH + NADP+ « NADPH + NADP+, und das Gleichgewicht der Reaktion ist wegen ihrer Kopplung an den Protonengradienten über der inneren Mitochondrienmembran zugunsten der NADPH Regeneration verschoben. In Mitochondrien erhält NADPH die antioxidative Kapazität, damit kommt der Nnt in erster Linie eine antioxidative Funktion zu. Eine häufig verwendete Mauslinie, die C57BL/6 Maus der Jackson Laboratories (BL/6J) weist eine Mutation auf, die zu einem Funktionsverlust der Nnt führt, während die C57BL/6N Mauslinie über eine intakte Nnt verfügt. Ziel der Arbeit: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle der Nnt für die antioxidative Kapazität in Herzmuskelzellen genauer zu charakterisieren. Es wurde die Hypothese untersucht, ob ein Fehlen der Nnt zu vermehrten oxidativen Stress führt. Hierfür wurden oben genannte Mausmodelle verwendet. Methoden: Die Experimente wurden an isolierten Herzmuskelzellen und homogenisiertem Myokard durchgeführt. Bei Experimenten an intakten Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) wurde in diesen entweder die Autofluoreszenz von NAD(P)H und FAD, oder alternativ das mitochondriale Membranpotential (ΔΨm) mit TMRM zusammen mit zytosolischen Calcium-Konzentrationen (mit Indo-1), die mitochondriale Superoxidproduktion (mit MitoSOX) oder die zelluläre H2O2 Akkumulation (mittels DCF) bestimmt. Darüber hinaus wurde die Sarkomerverkürzung der Zellen während elektrischer Stimulation mit einer CCD-Kamera gemessen. Bei den Experimenten an homogenisiertem Myokard wurde die Produktion von Superoxid mit Lucigenin sowie die Autofluoreszenz von NAD(P)H bestimmt. Ergebnisse: In isolierten Kardiomyozyten, die einer physiologischen Stimulation mit Anheben der Stimulationsfrequenz von 0.5 auf 5 Hz unter ß-adrenerger Stimulation ausgesetzt wurden, traten keine Unterschiede zwischen BL/6J und BL/6N hinsichtlich Sarkomerverkürzung, intrazellulärer Calcium-Konzentration, mitochondrialem Membranpotential oder Superoxidproduktion auf. Allerdings kam es in BL/6J Mäusen zu einer stärkeren Akkumulation von H2O2 (p<0,05), was ggf. auf das Fehlen der für die antioxidative Kapazität benötigten Vorwärts-Reaktion der Nnt mit NADPHRegeneration zurückzuführen ist. Während der Kalibrierung des NAD(P)H Redoxstatus wurden -durch Applikation des Atmungsketten-Entkopplers FCCPBedingungen simuliert, die zu einer selektiv erhöhten Arbeitslast durch Verbrauch von NADH an der Atmungskette führen. Hierbei kam es zu einer stärkeren Oxidation des gesamten NAD(P)H Pools in BL/6N als in den BL/6J Myozyten, was auf das Fehlen des NADPH-Verbrauchs über die reverse Nnt Reaktion in BL/6J Myozyten zurückgeführt wurde. Deshalb wurde in den BL/6J Myozyten nur der NADH-, aber nicht der NADPH Pool verbraucht. In BL/6N Myozyten kam es hingegen durch die reverse Nnt Reaktion nach Verbrauch von NADH über die Atmungskette auch zu einer vollständigen Oxidation von NADPH. Als Positivkontrolle diente die Applikation von H2O2, welches in beiden Genotypen die komplette Oxidation des NADH und NADPH Pools verursachte. In homogenisiertem Myokard konnte die reverse Nnt Reaktion durch Bedingungen reproduziert und quantifiziert werden, in denen die Konzentrationen von NADPH und NAD+ hoch-, und von NADP+ und NADH niedrig waren. Schlussfolgerungen: Die bekannte antioxidative Rolle der Nnt, die durch ihre Vorwärtsreaktion und NADPH Regeneration erklärt wird, konnte mit der Beobachtung einer erhöhten H2O2 Detektion in Nnt-defizienten BL/6J Myozyten während physiologischem Stress untermauert werden. Bei pathologischer Arbeitslast überschreitet der NADH-Verbrauch an der Atmungskette die NADH-Regeneration im Citratzyklus, und die resultierende NADH Netto-Oxidation provoziert die Umkehr der Nnt Reaktion (NADPH + NAD+ ® NADH + NADP+), was NADPH Oxidation und vermehrte H2O2 Emission herbeiführt. Mit dieser überraschenden Erkenntnis über die reverse Nnt Reaktion bietet diese Arbeit einen neuen zentralen pathophysiologischen Mechanismus der Herzinsuffizienz, der oxidativen Stress durch eine erhöhte Arbeitslast erklärt.

The nicotinamide nucleotide transhydrogenase: Yin Yang of antioxidative capacity in cardiomyocytes Background: Oxidative stress is causally linked to the onset and progression of heart failure and refers to an imbalance between production and elimination of reactive oxygen species (ROS). Important sources of ROS in the heart are the NADPH oxidase (NOX) and mitochondria. The mechanisms of mitochondrial ROS emission are incompletely resolved. In mitochondria, the nicotinamide nucleotide transhydrogenase (Nnt) catalyzes the reaction NADH + NADP+ « NADPH + NAD+. Through coupling to the proton gradient across the inner mitochondrial membrane, the equilibrium of this reaction shifts towards NADPH regeneration. Since NADPH maintains the antioxidative capacity in mitochondria, the Nnt has primarily an antioxidative function. A widely-used mouse strain, the C57BL/6 by Jackson laboratories (BL/6J) has a loss-of-function mutation of the Nnt, while the C57BL/6N strain has an intact Nnt. The aim of the thesis was to resolve the interplay between Nnt and antioxidative capacity. We hypothesized that Nnt deficiency triggers oxidative stress in cardiac myocytes. Methods: Experiments were performed on isolated cardiac myocytes and homogenated myocardium. In cardiac myocytes, the autofluorescence of NAD(P)H and FAD or alternatively, the mitochondrial membrane potential (ΔΨm; with TMRM) was determined together with cytosolic calcium concentrations (using Indo-1). In further experiments, mitochondrial superoxide production (via MitoSOX) or H2O2 accumulation (with DCF) were determined. Furthermore, sarcomere shortening during electrical stimulation was recorded by a CCD-camera. In experiments using homogenated myocardium, superoxide production was detected by lucigenin and the NAD(P)H redox state by its autofluorescence. Results: In isolated cardiac myocytes exposed to an increased stimulation frequency from 0.5 to 5 Hz under β-adrenergic stimulation, sarcomere shortening, intracellular calcium concentrations, mitochondrial membrane potential and superoxide production were similar between BL/6J and BL/6N myocytes. In contrast, H2O2 accumulation was more pronounced in Nnt-deficient BL/6J myocytes (p<0.05). This may be explained by the lack of NADPH regeneration by the Nnt which may deteriorate the antioxidative capacity. During the calibration of the NAD(P)H redox state, conditions of a selective increase of workload by consumption of NADH via the electron transport chain (ETC) are simulated via applications of the ETC uncoupler FCCP. During this condition, a more pronounced oxidation of the NAD(P)H pool in BL/6N versus BL/6J myocytes was observed, explained by the missing NADPH consumption via the reverse Nnt reaction in BL/6J. Therefore, only NADH, but not NADPH were oxidized. In contrast, in the BL/6N myocytes, NADPH is converted to NADH while NADH is consumed by the ETC. As a positive control, exogenous H2O2 oxidized both NADH and NADPH in both mouse strains. In homogenized myocardium, the reverse mode of the Nnt was quantified by NADH regeneration in the presence of high NADPH and NAD+ concentrations. Conclusions: During a physiological increase in workload, the Krebs cycle regenerates sufficient amounts of NADH to support the forward reaction of the Nnt, which regenerates NADPH which in run fuels the anti-oxidative capacity to eliminate H2O2. In contrast, during pathological workload, excessive oxidation of NADH provokes the reversal of the Nnt reaction, which then regenerates NADH from NADPH and thereby, depletes the antioxidative capacity. With this surprising finding of the reverse Nnt mode, this work identifies a novel and possibly central pathophysiological mechanism for heart failure, which could explain the onset of oxidative stress during a pathological increase of workload.