Pathogenetische Eigenschaften von ERj3, ERj6 und Sec62

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der Hsp40-Cochaperone ERj3 und ERj6 sowie Sec62 in Bezug auf deren mannigfaltige Funktionen im endoplasmatischen Retikulum. Besondere Beachtung fanden hier die Auswirkungen des erhöhten Calciumausstroms über Sec61 nach Depletion jedes der genannten Proteine, namentlich dessen Effekte auf Migration, Proliferation und das Zytoskelett. Weiterhin wurden der Zusammenhang eines ERj6-Mangels mit Neurodegeneration und Diabetes mellitus untersucht. Eine letzte Zielsetzung fand sich in der Betrachtung des Interaktoms von Sec62 mit besonderem Blick auf die molekularonkologisch relevanten Interaktionspartner. Zur Klärung der gestellten Fragen kamen unterschiedlichste Methoden der Zellkultur und der Proteinbiochemie zum Einsatz. So zeigten HeLa-Zellen nach Depletion von ERj3 beziehungsweise ERj6 in Migrationsassays ein signifikantes Migrationsdefizit. Parallel mithilfe des xCelligence-Systems angefertigte Proliferationsanalysen legten dar, dass dieses unabhängig einer Vitalitätseinschränkung der untersuchten Zellen bestand. Um die Vulnerabilität ERj3- beziehungsweise ERj6-depletierter Zellen gegenüber ER-Stress zu evaluieren, wurden diese während der besagten Proliferationsanalysen mit Thapsigargin behandelt. Dies führte zu einem tendenziell erkennbaren, statistisch allerdings nicht signifikanten Proliferationsdefizit von HeLa-Zellen, in denen jeweils eines der Hsp40- Cochaperone RNA-Interferenz-basiert depletiert wurde. Ähnliches zeigte sich in fluoreszenzmikroskopischen Versuchen zum Aktinzytoskelett von HeLa-Zellen, das sich weder nach „silencing“ von ERj3 noch von ERj6 erkennbar veränderte. Die Auswirkungen eines konstitutiven ERj6-Mangels wurden anhand der Fibroblasten einer Familie mit erblicher Neurodegeneration und Diabetes mellitus untersucht. Diese zeigten in Western Blot-Kontrollen des UPR-induzierten Proteins GRP170 keinen dauerhaft erhöhten ER-Stress, reagierten jedoch tendenziell sensibler auf durch Tunicamycin induzierten ERStress als gesunde Kontroll-Fibroblasten. Die genannten Befunde sprechen zusammenfassend für Redundanzen in den Funktionen von ERj3 und ERj6, die sich durch zuvor publizierte Befunde zum additiven Effekt einer Co-Depletion auf das Calciumleck des ER bekräftigen lassen. Im Verlauf der beschriebenen Untersuchungen wurde eine Methode zur zuvor nicht möglichen Herstellung von Migrationsassays nach Plasmidtransfektion erarbeitet. Um das Interaktom von Sec62 weitergehend zu bestimmen, wurden Co- Immunopräzipitationen mit anschließender Western Blot-Kontrolle der präzipitierten Proteine durchgeführt. Hierbei wurde gezeigt, dass Sec62 mit Vimentin und Hsp70 interagierte. Beide Proteine wurden in der rezent veröffentlichten Literatur als potentielle Tumormarker oder Zielstrukturen einer „targeted therapy“ diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wurden demnach die Hsp40-Cochaperone ERj3 und ERj6 als wichtige Komponenten in der Calciumhomöostase des endoplasmatischen Retikulums bestätigt und in ihren pathophysiologischen Eigenschaften näher charakterisiert. Gerade ERj6 zeigte sich hier als Bindeglied zwischen ER-Stress und Neurodegeneration sowie Diabetes mellitus. Sec62 deutete daneben als in der Tumorbiologie hochrelevante Struktur weitere Mechanismen seiner Einflussnahme auf die Entstehung maligner Erkrankungen an.

The purpose of this work was the characterization of the hsp40-co-chaperones ERj3 and ERj6, as well as Sec62 in regard to their many functions in the endoplasmic reticulum. Special attention was payed to the effects of an increased calcium leakage from Sec61 after depletion of each of the aforementioned proteins, namely on its effects on migration, proliferation and the cytoskeleton. Another aim was the evaluation of a genetically caused loss of ERj6 and the resulting phenotypes of neurodegeneration and diabetes mellitus. Lastly efforts were undertaken to study the interactome of Sec62 which was done with a focus on proteins with relevance to molecular oncology. To answer the asked questions, different methods of cell culture and protein biochemistry were applied. For one, HeLa cells showed signifanct migratory impairment in migration assays after ERj3 or ERj6 were depleted. Simultaneously conducted proliferation analysis with the xCelligence system confirmed that this migratory impairment was not due to lack of vitality, but resulted from specific effects of the protein depletion. To evaluate the potential increase in vulnerability to ER stress, ERj3 or ERj6 depleted HeLa cells were treated with increasing amounts of thapsigargin during the xCelligence proliferation analysis. The observed proliferation deficit and increased susceptibility to thapsigargin in these cells showed tendencies of significance but did not hold up to statistic testing. Similarly, the RNA interference based silencing of one of the mentioned hsp40-co-chaperones did not lead to any changes in the structure of HeLa cells‘ actin cytoskeleton which was tested via immunostaining fluorescence microscopy. The consequences of a constitutive lack of ERj6 were studied by using cultured fibroblasts derived from a family with a history of inherited neurodegeneration and diabetes mellitus. These showed no signs of elevated basal ER stress. This conclusion was drawn after western blot analysis showed no difference in the GRP170 content of fibroblasts carrying the mutated ERj6 in comparison to healthy controls. However, the diseased cells reacted more sensitively to tunicamycin induced ER stress. All these findings support the theory that ERj3 and ERj6 share mutual functionalities and are redundant in regard to their functions in chaperoning and ER calcium homeostasis. This is further underlined by previously published data showing an additive effect on calcium leakage from the ER after co-silencing of the two hsp40-co-chaperones. While conducting research on ERj3, ERj6, Sec62 and their effects on the migratory potential of HeLa cells, a new method was established, allowing the hitherto impossible use of plasmid transfected cells in migration assays. To create a better understanding of the interactome of Sec62 co-immunoprecipitations were performed. After western blot analysis of the precipitated proteins, Hsp70 and Vimentin were shown to interact with Sec62. In recently published literature, both proteins were discussed as potential tumor markers or targets for personalized treatments. In this work, the hsp40-co-chaperones ERj3 and ERj6 were further characterized as important components of ER calcium homeostasis and their roles in pathophysiological processes were illuminated. Especially ERj6 turned out to be a link between ER stress, neurodegeneration and diabetes mellitus. Sec62 on the other hand cemented its standing in molecular oncology as a driving force in tumorigenesis and the development of targeted therapies.