Functions of SNARE Regulators and v-SNARE Transmembrane Domain in Ca2+-triggered Exocytosis

Abstract

Summary Calcium-dependent exocytosis mediates the release of neurotransmitters, hormones, neuropeptides, small proteins and digestive enzymes. During the past three decades, the key proteins that participate in this process have been well characterized. Several proteins work together to allow the membrane-bound secretory vesicles to fuse with the plasma membrane in order to release the aqueous content. SNARE proteins (soluble Nethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor) have been identified as the core of the fusion machinery that requires auxiliary proteins to couple the triggering Ca2+-stimulus to the fusion event. The first part of this thesis work studied the functional role of two auxiliary proteins, ComplexinII (CpxII) and SynaptotagminI (SytI). These proteins have been implicated in regulating the function of SNARE proteins, but the precise mode of action and potential interaction have remained elusive. The present work shows that CpxII increases Ca2+- triggered exocytosis and speeds up its secretory rates, contributing to two independent but synergistic functions, to increase synchronous release. In the framework of a structure-function analysis, it became clear that the C terminus enhances the pool of primed vesicles by impeding premature secretion at submicromolar Ca2+ concentrations, whereas the N terminus shortens the secretory delay and accelerates the stimulussecretion coupling by increasing the Ca2+ affinity of secretion. The comparative analysis of single null mutants for CpxII and SytI, as well as their compound deficiency (double knock-out CpxII/SytI), shows that SytI and CpxII control the extent of evoked-release by different mechanisms. Overall, these results clarify how CpxII and SytI transform the constitutively active SNARE-mediated fusion mechanism into a highly synchronized, Ca2+-triggered release apparatus. Regulated exocytosis is expected not only to rely on protein-protein interactions but also protein-lipid interactions. Yet, the functional role of SNARE-lipid interactions has remained largely unclear. In particular, it is unknown whether transmembrane domains (TMDs) of SNARE proteins have functions that go beyond passive anchoring of the force-generating SNARE-apparatus. The present work shows that conformational flexibility of the TMD of vesicular SynaptobrevinII is crucial for efficient Ca2+- triggered exocytosis and dynamically supports membrane fusion. Specifically, the present work shows that a rigid -helical structure of the TMD (induced by helixpromoting leucine residues) spanning the outer leaflet of vesicular membrane strongly reduces secretion. Oppositely, increasing the number of helix-destabilizing, ß-branched valine residues within the TMD rescues secretion to the wild-type level. These findings support a new model for membrane fusion, wherein SNARE force (generated by zipping SNAREs) together with membrane perturbation induced by structural flexibility of the v-SNARE TMD facilitates membrane merger.

Zusammenfassung Die Kalzium-abhängige Exocytose vermittelt die Freisetzung von Neurotransmittern, Hormonen, Neuropeptiden, kleinen Proteinen und Verdauungsenzymen. In den vergangenen drei Jahrzehnten wurden die wichtigsten Proteine, die an diesem Prozess beteiligt sind, identifiziert und charakterisiert. SNARE-Proteine („soluble Nethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor“) wurden als Kern der Fusionsmaschinerie identifiziert, die akzessorische Proteine benötigt, um den auslösenden Ca2+-Stimulus an das Fusionsereignis zu koppeln. Der erste Teil dieser Arbeit untersucht die funktionelle Rolle von zwei akzessorischen Proteinen, dem ComplexinII (CpxII) und dem SynaptotagminI (SytI). Beide Proteine scheinen an der Regulation der SNARE-Proteine beteiligt zu sein sind, ihre eigentliche Wirkungsweise sowie potentielle Wechselwirkungen sind jedoch weitgehend unverstanden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass CpxII sowohl das Ausmaß der Ca2+- gesteuerten Exozytose erhöht als auch die Stimulus-Sekretions-Kopplung beschleunigt. Somit vermittelt CpxII zwei unabhängige, aber synergistisch wirkende Funktionen, um die synchrone Transmitterfreisetzung zu steigern. Im Rahmen einer umfassenden Struktur-Funktions-Analyse wurde klar, dass einerseits der C-terminus von CpxII durch Inhibition vorzeitiger Sekretion bei submikromolaren Ca2+-Konzentrationen die Akkumulation von Vesikeln im Exozytose-kompetenten Zustand erleichtert und der Nterminus andererseits die Sekretionsrate dieser Vesikel erhöht. Die vergleichende Analyse einzelner Nullmutanten für CpxII und SytI sowie der entsprechenden Doppel- Nullmutante (double knock-out CpxII/SytI) zeigt, dass SytI und CpxII in der Kontrolle der evozierten Transmitterfreisetzung kooperieren, jedoch ihre Wirkung durch unterschiedliche molekulare Mechanismen vermitteln. Insgesamt erlauben die erarbeiteten Befunde einen neuen Einblick in Mechanismen, mit denen CpxII und SytI die konstitutiv-agierende SNARE-Maschinerie in einen hoch-synchronisierten, Ca2+- getriggerten Fusionapparat umwandeln. Die Ca2+-regulierte Exocytose beruht aller Voraussicht nach nicht nur auf Protein- Protein-, sondern auch auf Protein-Lipid-Wechselwirkungen. Im Gegensatz zu Protein Protein-Interaktion ist die funktionelle Rolle der SNARE-Lipid-Wechselwirkungen noch weitgehend unverstanden. So ist z.B. unklar, ob die Transmembrandomänen (TMDs) von SNARE-Proteinen neben ihrer Rolle als Membrananker noch zusätzliche, aktive Funktionen im Fusionsvorgang übernehemen In der Tat legen die experimentellen Befunde nahe, dass konformationelle Flexibilität der TMD des vesikulären SynaptobrevinII die Ca2+-getriggerte Exozytose entscheidend unterstützt. Es wird vermutet, dass das Fluktuationen in der Helixstruktur der TMD zu lokalen Membrandefekten führen und somit den Vorgang der Membranverschmelzung einleiten. So zeigen die Resultate, dass eine starre -helikale Struktur der TMD (induziert durch Helix-fördernde Leucinreste) im Bereich der äußeren Lipidschicht („outer leaflet“) der Vesikelmembran die Sekretionsantwort stark behindert. Im Gegensatz dazu erhöht die Anzahl Helix-destabilisierender, -verzweigter Valinreste innehalb der TMD die Sekretionsantwort auf das Niveau von Wildtypzellen. Zusammengefasst unterstützen die Ergebnisse ein Modell, in dem nicht nur membranverbindende, Kraft-vermittelnde Interaktionen der SNARE Proteine (Protein-Protein- Wechselwirkung) sondern auch die Erzeugung lokaler Membrandefekte durch strukturelle Flexibilität der Membrananker von v-SNARE Proteinen (Protein-Lipid- Wechselwirkung) die Membranfusion erleichtert.