In depth analysis of the HIV-specific CD8 T cell response in seropositives exposed to a mixed subtype epidemic

Abstract

The importance of HLA class I restricted CD8 T cell response in the control of HIV infection is generally accepted, yet few studies have shown a correlation of the CD8 T cell response with markers of HIV disease progression. Disease progression is dependent on several factors such as the virus load at set-point, rarely occurring mutations in the HIV co-receptor genes or the HLA class I alleles expressed by an HIV infected individual. It has been shown previously that particular HLA class I alleles are associated with a low plasma viral load. However, a relationship between these "protective'; HLA class I alleles and an efficient HIV-specific CD8 T cell response has not yet been demonstrated. In order to study the mechanism underlying the beneficial effect of "protective'; HLA class I alleles, 53 HIV-1 seropositive individuals from a high-risk cohort in southwest Tanzania were HLA-typed and the plasma viral load and CD4 counts were determined. The recognition of CD8 T cell epitopes within Gag, Nef and Env was analysed using a gamma interferon ELISPOT assay and freshly isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC).

Gag and Nef were frequent targets of the HIV-specific CD8 T cell response with a median recognition of 3 Gag, 2 Nef and 1 Env epitopes per individual. The HLA class I alleles B5801, B8101 and B0702 were associated with a low median plasma viral load. At the same time expression of these correlated with a broader recognition of Gag epitopes (P = 0.0035), if compared with all other common HLA class I alleles. Further analysis of the Gag-specific T cell response revealed an inverse linear relationship between the number of Gag epitopes recognized and the plasma viral load (R = -0.36, P = 0.0016). Particularly, recognition of multiple epitopes within two regions of Gag (aa001-aa075 and aa248-aa500) was strongly associated with the maintenance of a low viral load, indicating that this pattern of HIV-specific CD8 T cell recognition is important for the control of viral replication during the chronic phase of HIV infection.

In the second part of the present work, recognition of Gag and Nef variant epitopes was analysed using HIV-1 subtype A, C and D derived peptides. 83% of the Gag-specific responses were detected with subtype C derived peptides, whereas only 51% and 57% of responses were detected with subtype A or D peptides, respectively. The superiority of the subtype C Gag peptides for detecting CD8 T cell responses may in part reflect the predominance of subtype C and C-containing recombinant HIV-1 strains within the studied cohort. Nonetheless, screening for CD8 T cell responses with any one subtype-specific peptide set detected fewer responses and underestimated the breadth and the magnitude of responses within individuals, compared to the combined peptide sets from the three subtypes. Cross-subtype recognition for the 16 most frequently recognized peptides was identical only when the peptide sequences were invariant; in 9 of these 16 peptides, diminished recognition was the result of subtype-related sequence variation, and a frame-of-epitope effect diminished or abrogated recognition in 4 peptides. A minimal set of 15 frequently recognized Gag and Nef peptides was then designed and tested with cells from 50 HIV seropositive individuals and elicited responses in 47 of them, at a mean frequency of 715 SFC/106 peripheral blood mononuclear cells. Therefore incomplete cross-recognition between subtypes A, C, and D can be partially overcome using a defined peptide set representing frequently recognized epitopes, and potentially, by adjusting epitope frame within peptides. These strategies can help to define optimal vaccine epitopes.

In the third part of the present work, the Gag-specific CD8 T cell response of individuals infected with a single HIV strain was compared with the response observed in individuals infected with multiple HIV-1 strains. Breadth of Gag epitope recognition and cross-recognition of subtype-specific peptide pools was enhanced in multiply infected study subjects, whereas CD8 T cell recognition of Nef or Env appeared to be unaffected. Therefore the increased viral diversity in individuals infected with multiple HIV-1 strains affects the Gag-specific T cell response. As a consequence inclusion of multiple Gag variants in a HIV vaccine is likely to enhance vaccine-induced CD8 T cell responses and cross-recognition of HIV epitopes.

Es ist allgemein akzeptiert, daß die HLA Klasse I restringierte CD8 T Zellantwort bei der Kontrolle der Virusreplikation während einer HIV Infektion eine entscheidene Rolle spielt. Allerdings konnten nur wenige Studien eine Korrelation zwischen der HIV-spezifischen CD8 T Zellantwort und dem Krankheitsverlauf nachweisen. Der Krankheitsverlauf hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter die Viruslast nach der Primaervirämie, selten vorkommenden Mutationen in den HIV Korezeptorgenen, oder den HLA Klasse I Allelen. So geht beispielsweise die Expression bestimmter HLA Klasse I Allele mit einer niedrigen Plasma Viruslast einher. Eine Verbindung zwischen solchen "protektiven'; HLA Klasse I Allelen und einer effizienten HIV-spezifischen CD8 T Zellantwort konnte jedoch bisher noch nicht nachgewiesen werden. Zur Beantwortung des zugrundeliegenden Mechanismus, der mit "protektiven" HLA Allelen verbunden ist, wurden 53 HIV infizierte Frauen einer Hochrisikokohorte im Südwesten Tansanias bezüglich des HLA Typs, der Viruslast im Plasma und der CD4 T Zellzahl charakterisiert. Gleichzeitig wurde die Gag-, Nef- und Env-spezifische CD8 T Zell Antwort unter Verwendung eines Interferon gamma ELISPOT Assays bestimmt. Am häufigsten fanden sich in den Studienteilnehmerinnen CD8 T Zellantworten gegen Epitope in Gag und Nef, weniger häufig gegen Epitope in Env (Median: 3 Gag, 2 Nef und 1 Env erkannte Epitope/Individuum). Die HLA Klasse I Allele B5801, B8101 und B0702 waren mit einer niedrigen Viruslast assoziiert. Gleichzeitig korrelierte die Expression von einem oder zwei dieser Allele mit einer breiteren Erkennung von Gag Epitopen (P =0,0035, Median:4 erkannte Epitope/Individuum) verglichen mit anderen HLA Klasse I Allelen (Median: 2 erkannte Epitopen/Individuum). Die weitere Analyse der Gag-spezifischen CD8 T Zell Antwort offenbarte ein inverses lineares Verhätnis zwischen der Anzahl der erkannten Gag Epitope und der Viruslast im Plasma (R =-0,36 ; P = 0,0016). Des weiteren war die Erkennung von multiplen Epitopen in 2 Regionen des Gag Proteins (as001-as075 und as 248-500, GagR1R3) stark mit einer dauerhaften Kontrolle der Virusreplikation nach Serokonversion assoziiert. Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse darauf schließen, daß die Erkennung multipler Epitope im Gag Protein, ganz besonders in GagR1R3, wichtig für die Kontrolle der Virusreplikation während der chronischen Phase der HIV Infektion ist. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Erkennung von HIV-1 Subtyp A-, C- und D-spezifischen Gag und Nef Epitopvarianten durch CD8 T Zellen untersucht. 83% der Gag-spezifischen Epitopantworten wurden mit den Subtyp C Peptiden detektiert, während lediglich 51% und 57% der Gag-spezifischen Epitopantworten mit den Subtyp A beziehungsweise Subtyp D Peptiden detektiert wurden. Die erhöhte Frequenz Subtyp C-spezifischer Antworten könnte zum Teil mit dem vorherrschenden Vorkommen Subtyp C und Subtyp C-beinhaltenender rekombinanter HIV-I Stämme in Südwest Tanzania zusammenhängen. Dennoch würde die Anzahl der Gag-spezifischen Epitopantworten durch die ausschließliche Verwendung von Subtyp C-spezifischen Peptiden unterschätzt. Die Erkennung von Subtyp-spezifischen Peptidevarianten durch CD8 T Zellen war lediglich für Peptide gleicher Aminosäuresequenz identisch. Für 9 der 16 am häufigsten erkannten Peptide konnte eine abgeschwächte Erkennung von Varianten des selben Peptids mit Aminosäuresequenzunterschieden erklärt werden. Für 4 Peptide konnte eine abgeschwächte Erkennung von Peptidvarianten mit einer unterschiedlichen Positionierung des Epitops innerhalb der Peptidvarianten erklärt werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde ein minimales Set aus 15 der am häufigsten erkannten Peptiden zusammengestellt Dieses bestand vor allem aus Subtyp C-spezifischen, aber auch aus Subtyp A- und D-spezifischen Peptiden und wurde anschließend mit peripheren mononuklären Blutzellen ("peripheral blood mononuclear cells", PMBC) von 50 HIV infizierten Personen auf Erkennung getestet. Dieser Peptidpool wurde mit einer durchschnittlichen Frequenz von 715 SFC/106 PBMC von 47 dieser Personen erkannt. Zusammenfassend könnte diese Strategie dazu beitragen, optimale CD8 T Zell Epitopevarianten zu identifizieren, die in HIV Impfungen beinhaltet sein sollten. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Gag-spezifische CD8 T Zell Antwort von Studienteilnehmerinnen verglichen, die mit einem oder mehreren verschiedenen HIV-1 Stämmen infiziert waren. Eine Mehrfachinfektion führt dazu, daß mehr Gagepitope erkannten werden. Darüber hinaus war auch die gleichzeitige Erkennung von subtypspezifischen Peptiden in diesen Studienteilnehmerinnen besser ausgeprägt. ... Für einen potentiellen HIV Impfstoff lässt sich aus der vorliegenden Arbeit schließen, daß es entscheidend sein kann, eine effiziente CD8 T Zellantwort zu induzieren. Vor allem sollten hierbei Gag-spezifische Epitopevarianten verschiedener Subtypen berücksichtigt werden.