Untersuchungen zur Lokalisation und Wirkung des viralen K28α-Toxins in Hefezellen

Abstract

Das viral kodierte Killertoxin K28 ist ein heterodimeres A/B-Toxin, das bei sensitiven Hefezellen einen Zellzyklusarrest am Übergang von der G1- zur S-Phase induziert. Nach Bindung an die Zellwand und Translokation zum Sekundärrezeptor auf der Plasmamembran durchläuft das Toxin retrograd den Sekretionsweg über Golgi-Apparat und ER, aus dem es in das Zytoplasma retrotransloziert. Die Disulfidbrücke zwischen der α- und β-Untereinheit wird getrennt und K28β proteasomal degradiert. Die zytotoxische α-Untereinheit von K28 entfaltet im Zellkern ihre letale Wirkung, was sich in einem Zellzyklusarrest am Übergang von der G1- zur S-Phase und einer irreversiblen Hemmung der DNA-Synthese äußert. Der Fokus der vorliegenden Arbeit richtete sich u.a. auf die Verifizierung der nukleären Lokalisation von K28α. Die bisherigen, indirekten Hinweise auf einen Kernimport von K28α wurden mittels forcierten Kernimport- und -exportstudien bestätigt und erweitert. Trotz vielfältiger Bemühungen gelang es nicht, K28α durch mikroskopische Techniken direkt im Nukleus zu detektieren. Bei der näheren Charakterisierung des durch K28 induzierten Zellzyklusarrests konnten Apc2p und Spt15p mittels BiFC-Analyse als potentielle Interaktionspartner von K28α in vivo bestätigt werden. Durch die Analyse von Deletionsmutanten sowie durch Überexpressionsstudien konnte ein Einfluss von K28 auf die Transkriptions-maschinerie nachgewiesen und durch eine globale Transkriptomanalyse mittels RNA-Seq bestätigt werden.

The virally encoded killer toxin K28 is a heterodimeric A/B toxin that induces a cell cycle arrest at the transition from G1- to S-phase in sensitive yeast cells. After binding to the cell wall and translocation to the secondary receptor at the plasma membrane, the toxin travels the secretory pathway retrogradely through Golgi apparatus and ER from where it is retrotranslocated into the cytoplasm. The disulphide bond between the α- and β-subunit is reduced and K28β is proteasomaly degraded. The cytotoxic α-subunit of K28 exerts its lethal effect in the nucleus which is manifested by a G1/S cell cycle arrest and an irreversible inhibition of DNA synthesis. The focus of the present work mainly addressed the verification of the nuclear localization of K28α. Hitherto indirect evidence for a nuclear import of K28α was confirmed and extended by forced nuclear import and export studies. Despite manifold efforts it was not possible to detect K28α directly in the nucleus with microscopic techniques. By detailed characterization of the K28-induced cell cycle arrest, the potential interaction partners of K28α, Apc2p and Spt15p, could be confirmed in vivo via BiFC analysis. The study of deletion mutants as well as overexpression studies verified the effect of K28 on the transcription machinery which was further confirmed by a global transcriptome analysis via RNA-Seq.