Discovery and optimization of 1,3,5-trisubstituted pyrazolines as potent and highly selective allosteric inhibitors of PKCzeta

Abstract

The atypical PKCζ is a promising therapeutic target in inflammatory diseases and B cell lymphoma. Therefore, there is an increasing need to develop selective inhibitors for this enzyme without affecting the closely related PKC family members. Allosteric inhibitors were found to be an effective tool in achieving this aim. Optimization yielded the 1,3,5-trisubstituted pyrazoline scaffold which proved to be rich in modifiable sites, all acting as hot spots for improving binding affinity. The phenolic group at the 5-phenyl was essential for activity. The presence of a lipophilic substituent at the 1-phenyl was important for high potency. The 3-position was tolerant for diverse types of substituents, acting as a means to optimize polarity and physicochemical characteristics. A methyl group at the 4-postion of the pyrazoline increased the potency, and was reported to enhance pyrazoline’s chemical stability. The optimized compounds showed two orders of magnitude improvement in the cell free assay potency and more than 10 times increase in cellular potency in U937 cells. The compounds showed high selectivity for PKCζ vs. the closely related PKCɩ and other PKCs, and were most likely targeting the PIF-pocket. Since the pyrazoline scaffold showed shape complementarity also to the p53-Mdm2 interaction site, the ability to compete this other protein-protein interaction was tested. However, the compounds which showed potent growth inhibition in cells failed to show activity in the binding assay.

Die atypische PKCζ ist ein vielversprechendes Target bei Entzündungserkrankungen und B-Zell-Lymphomen. Daher besteht ein Bedarf, selektive Inhibitoren dieses Enzyms zu entwickeln, welche eng verwandte PKC-Isoformen nicht hemmen. Allosterische Hemmstoffe stellten gute Ansatzpunkte zum Erreichen dieses Zieles dar. Eine Optimierung führte zu 1,3,5-trisubstituierten Pyrazolinen, die an vielen Positionen vorteilhaft modifiziert werden konnten, was jeweils in einer effektiven Erhöhung der Bindungsaffinität resultierte. Der Phenolrest in der 5-Position war dabei essentiell für die biologische Aktivität. Ebenso war die Anwesenheit eines lipophilen Substituenten am 1-Phenylrest wichtig für eine hohe Potenz. An der 3-Position wurden verschiedene Arten von Substituenten toleriert, so dass hier die Polarität der Verbindungen und weitere physikochemische Eigenschaften optimiert werden konnten. Eine Methylgruppe an der 4-Position des Pyrazolins erhöhte die Wirkstärke zusätzlich und wurde zugleich als stabilisierend auf die chemische Stabilität beschrieben. Die optimierten Hemmstoffe zeigten eine um zwei Größenordnungen höhere Potenz im zellfreien Assay und eine 10-fach bessere Wirksamkeit im U937-Zellassay als die Ausgangsverbindungen. Die Verbindungen besaßen eine hohe Selektivität für PKCζ gegenüber der stark homologen PKCι und weiteren PKC-Isoenzymen, und griffen wahrscheinlich an der PIF-Tasche an. Da das Pyrazolingerüst auch eine Formkomplementarität zur p53-Mdm2-Interaktionsstelle aufwies, wurde die Fähigkeit, diese andere Protein-Protein-Interaktion zu kompetitieren, gestestet. Für diejenigen Verbindungen, die eine potente Hemmung des Zellwachtums zeigten, konnte jedoch keine Aktivität im Bindungsassay nachgewiesen werden.