Hydroxylierung bioaktiver Naturstoffe mit CYP106A2 aus Bacillus megaterium - Screening, Biokatalyse und Produktcharakterisierung

Abstract

Die Funktionalisierung von Naturstoffen zur Steigerung ihrer Bioaktivität ist oftmals ein bedeutender Schritt der Arzneimittelentwicklung. Die Cytochrom P450 Monooxygenasen haben sich für diese Aufgabe als vielseitige Werkzeuge mit großem biotechnologischen Potential erwiesen. Das bakterielle CYP106A2 aus Bacillus megaterium ATCC13368 ist in der Lage pharmazeutisch interessante Substrate, wie Steroide, Di- und Triterpenoide, stereoselektiv zu hydroxylieren. In dieser Arbeit wurde ein auf der Methode der Differenzspektroskopie basierendes Screeningsystem für die Identifizierung neuer Substrate entwickelt und auf eine 502 Substanzen umfassende Naturstoffbibliothek angewendet. Das Screening ergab zwölf Treffer. Einhergehend mit einer rationalen Suche wurde das Substratspektrum von CYP106A2 um sieben bioaktive Naturstoffe erweitert; darunter das mit den Ginsenosiden verwandte Dipterocarpol und der Steroidhormonvorläufer Dehydroepiandrosteron. Die respektiven Reaktionsprodukte konnten mittels Ganzzellumsatz durch Bacillus megaterium ATCC13368 hergestellt und mittels NMR identifiziert werden. Durch Optimierung der Ganzzellkatalysen konnte die Produktivität deutlich gesteigert werden. Erste Untersuchungen zur Wirksamkeit der Reaktionsprodukte wurden durch in vitro Zytotoxizitätstest mit zwei Säugerzelllinien gemacht, wobei eine moderate Toxizität von 7b-OH-Dipterocarpol auf beide Zelllinien beobachtet wurde.

The functionalization of natural products in order to increase their bioactivity is often a critical step in drug development. For this cytochrome P450 monooxygenases emerged as a versatile tool with biotechnological potential. The bacterial CYP106A2 from Bacillus megaterium ATCC13368 is able to catalyze the stereoselective hydroxylation of pharmaceutical relevant substrates. In the present work, a screening system based on the method of difference spectroscopy was developed to identify new CYP106A2 substrates. The method was applied for the screening of a 502 compounds containing natural product library, resulting in twelve hits. Along with a rational susbtrate search the substrate spectrum of CYP106A2 was broadened by seven new compounds. Among them are the ginsenoside related dipterocarpol and the steroid hormone precursor dehydroepiandrosterone. Their respective reaction products could be produced using bacillus megaterium whole cell catalysis and the hydroxylation positions were determined with NMR-analysis.Optimization of the whole cell catalysis led to an explicit increase in productivity. First investiagations on possible bioactivities were performed using in vitro cytotoxicity assays with two mammalian cell lines. A moderate cytotoxicity of 7b-OH-dipterocarpol on both cell lines was observed.