Molecular engineering of bacterial natural product biosynthetic pathways via Red/ET recombineering

Abstract

Bacterial genome-sequencing projects have revealed that a large number of natural product biosynthetic pathways presented in genomes are cryptic. Cloning, engineering and expression of a cryptic biosynthetic pathway in a well-characterized heterologous host to discover and optimize its product is an effective alternate to traditional approaches. We developed RecE/RecT mediated linear-linear homologous recombination (LLHR) for direct cloning of ten unknown NRPS/PKS gene clusters from the genomic DNA of Photorhabdus luminescens into expression vectors in E. coli. Coupled with robust heterologous expression in E. coli, the products of plu3263 and plu1881-plu1877, luminmides A-G and luminmycins A-C, were determined, respectively. By site-directed modification of the third adenylation domain of NRPS Plu3263, we efficiently created mutants using ccdB counterselection recombineering, which led to a significant alteration of relative yields of luminmides A and B. Partial syringolin biosynthetic pathway (sylCDE) from Pseudomonas syringae was cloned by LLHR and expressed in E. coli resulting in the identification of two new syringolins. Intact syringolin pathway was reassembled by addition of sylAB and engineering of promoter via Red/ET recombineering. The varying production distribution of syringolins showed the different efficiencies of native and synthetic promoters in E. coli.

Bakterielle Genom-Sequenzierungsprojekte zeigten, dass zahlreiche im Genom vorhandene Sekundärmetabolit Biosynthesewege kryptisch sind. Um die Produkte zu entdecken und optimieren, ist Klonierung, Engineering und Expression von diesen Biosynthesewegen in einem gut charakterisierten heterologen System eine effektive Alternative zu traditionellen Ansätzen. Wir entwickelten die von RecE/RecT vermittelten linear-linear homologen Rekombination (LLHR) für die direkte Klonierung von zehn unbekannten NRPS/PKS-Genen aus Genom von Photorhabdus luminescens in E. coli-Expressionsvektoren. Mittels robuster heterologer Expression in E. coli wurden die Produkte von plu3263 und plu1881-plu1877, Luminmide A-G und Luminmycin A-C, jeweils identifiziert. Die ''site-directed'' Modifikation der dritten Adenylierungsdomaine von NRPS Plu3263 wurde effizient durch ccdB Conter-selektion Rekombination erstellt. Das führte dazu, dass sich die relative Ausbeute von Luminmides A und B stark veränderten. Der partielle Syringolin Biosyntheseweg (sylCDE) aus Pseudomonas syringae wurde durch LLHR kloniert und die Expression in E. coli versursachte die Identifizierung von zwei neuen Syringolinen. Der intakte Syringolin Biosynthesesweg wurde durch Zugabe von sylAB und Promotor-Engineering via Red/ET-Rekombination wieder zusammengesetzt. Die variierende Verteilung der Produktion aller Syringolin-derivate zeigte die unterschiedliche Effizienzen zwischen nativen und synthetischen Promotoren in E. coli.