High throughput toxicity, physiological and metabolic studies for the characterization of hepatocytes and human embryonic stem cell derived hepatocyte-like cells

Abstract

A dynamic respiration assay based on luminescence decay time detection of oxygen for high throughput toxicological assessment is presented. The method applies 24-well plates (OxoDishes). Dissolved oxygen concentration is measured by a SensorDishReader reading the oxygen sensor optodes immobilized in the centre of each well. This method allows LC50 calculations and recording of toxicokinetic profiles. Adherent primary rat hepatocytes and Hep G2 cell line were exposed to known toxic compounds. The novel assay showed to be robust, flexible and an improvement to current methods. Three human embryonic stem cell (hESC) lines, which have been directed towards hepatocyte-like cells were characterized and compared to Hep G2 cells and primary human hepatocytes for evaluation of their application for predictive toxicity testing and drug metabolism studies. In multi-well plate formats, repeatedly cells were identified to be hepatocyte-like by morphologic evaluation. Gene expression of liver specific genes and hepatic lineage markers were evaluated. The cells showed functional hepatic characteristics, such as albumin secretion, glycogen storage and urea synthesis. Phase I and phase II metabolism of midazolam, phenacetin and diclofenac was detected for the respective metabolites and the toxicity to diclofenac was confirmed by a toxicodynamics study. The characterization results described here provide a unique overview of the functionality of hESC derived hepatocytes. Multiple physiological and 13C-labeling studies on hESC derived epatocytes-like cells and primary human hepatocytes, exposed to sub-toxic diclofenac concentrations were performed to identify metabolic pathways. In addition, their response to drug treatment was evaluated. Glycolysis, TCA cycle, amino acid degradation, albumin synthesis and pyruvate (re)cycling were considered for a stoichiometric metabolic flux model. MFA analysis revealed influence of sub-toxic diclofenac concentrations on the oxidative phosphorylation pathway.

Eine dynamische Hochdurchsatz-Methode zur Bestimmung von Toxizität mittels Messung der Respiration via Lumineszenz-Abklingzeit wurde in dieser Arbeit präsentiert. Hierfür wurden 24-well Platten (OxoDishes) verwendet, die mit Hilfe eines SensorDishReaders die Messung der Gelöst-Sauerstoffkonzentrationen in Kulturmedium mittels immobilisierten Sensoroptoden ermöglichen. Hierdurch konnten LC50-Werte errechnet und toxikokinetische Profile erstellt werden. Es wurde gezeigt, dass diese neue Methode robust, flexibel und eine Verbesserung zu derzeitigen Methoden darstellt. Drei von humanen embryonalen Stammzellen (hESC) abgeleitete Hepatozyt-ähnliche Zellenlinien wurden charakterisiert und mit Hep G2 Zellen und primären Humanhepatozyten verglichen. Diese Studie wurde durchgeführt um die Anwendung dieser Zellen für prädiktive Toxizitäts- und Metabolismusstudien zu evaluieren. Hepatozyt-ähnliche Zellen konnten anhand ihrer Morphologie wiederholt identifiziert werden. Leberspezifische Genexpression und typische hepatische Charakteristika wie Albuminsynthese, Glykogenspeicherung und Harnstoffsynthese wurden identifiziert. Funktionelle Biotransformation der Medikamente Midazolam, Phenacetin und Diclofenac wurde anhand ihrer Metaboliten gezeigt und Diclofenactoxizität wurde zudem durch eine toxikodynamische Studie belegt. Die Ergebnisse der hier gezeigten Charakterisierungsstudie bieten einen Überblick über die Funktionalität der von Stammzellen abgleitenden Hepatozyten. Physiologische und 13C-Markierungsstudien wurden an hESC abgeleiteten hepatozytähnlichen Zellen und primären Humanhepatozyten durchgeführt, die subtoxischen Konzentrationen von Diclofenac ausgesetzt waren, um metabolische Stoffwechselwege und deren Störung in Erwiderung zur Medikamentierung zu identifizieren. Glykolyse, TCA-Zyklus, Aminosäreabbau, Albuminsynthese und Pyruvatzyklen wurden für ein stoichiometrisches metabolisches Flussmodel verwendet. Mittels metabolischer Flussanalyse, konnte der Einfluss von subtoxischen Diclofenac-Konzentrationen auf die Atmungskette gezeigt werden.