Quantifizierung der Konzentration von Kupfer(II)-ionen in lebenden Zellen durch Fluoreszenzlebensdauermikroskopie des Grün Fluoreszierenden Proteins

Abstract

Die Aufklärung intrazellulärer Vorgänge ist wichtig für das Verständnis der dort ablaufenden Prozesse. Lebensdauermikroskopie an Zellen, die Fluoreszenzproteine enthalten, ist eine geeignete Methode, um einen Einblick in lebende Zellen zu erhalten. Ein Ziel ist dabei die Verfolgung von für die Zelle wichtigen Substanzen und die zeitliche und räumliche Entwicklung ihrer Konzentration. In der vorliegenden Arbeit wird die Bestimmung der Cu2+ Konzentration in verschiedenen Zellen durch eine Änderung der Fluoreszenzlebensdauer von in die Zellen eingebrachtem Grün Fluoreszierendem Protein (GFP) dargestellt. Ursache hierfür ist die Bildung eines Komplexes zwischen Cu2+ und GFP. Die verantwortliche Bindungsstelle ist das His6-Tag. Außerdem wird der Mechanismus, der für die Abnahme der Lebensdauer verantwortlich ist, als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) identifiziert. Der Förster-Radius wird zu R0 = 2,1 nm bestimmt. Aufgrund der spektralen Voraussetzungen führt nur die Präsenz von Cu2+ zu einer Änderung der Lebensdauer, so dass ein selektiver Sensor entwickelt werden kann. Zur Quantifizierung von Cu2+ wird ein mathematisches Modell hergeleitet, das die Bestimmung der Konzentration aus der experimentell ermittelten Lebensdauer erlaubt. Die Quantifizierung von Cu2+ kann durch nicht intakte GFP-Moleküle verfälscht werden. Ein Modell zur exemplarischen Bestimmung der Bildungsseffizienz von GFP wird vorgestellt. Die Bildungsseffizienz wird dabei über die Lebensdaueränderung eines an das GFP gelabelten Farbstoffes bestimmt.

The investigation of intracellular procedures is an important aspect of understanding the processes that occur there. Fluorescence microscopy of cells which contain fluorescent proteins, is a suitable method for gaining insight into living cells. One objective is the tracking of substances that are important for cells and the temporal and spatial development of their concentration. In this work the determination of the Cu2+ concentration in different cells via the lifetime changes of green fluorescent protein (GFP) in cells is described. This is possible due to the formation of a complex consisting of copper ions and GFP. The binding site responsible for this is the His6-tag. The mechanism causing the lifetime change is identified as the Förster resonance energy transfer (FRET). The Förster radius is given as R0 = 2,1 nm. Due to the spectral conditions, only the prescence of Cu2+ leads to a change in lifetime - this makes it possible to develop a selective sensor. A mathematical model for the quantification of Cu2+ is generated, which enables the Cu2+ concentration to be determined on the basis of the experimental lifetime measurements. The quantification of Cu2+ may be distorted by incompletely formed GFP molecules. A model for determining the formation efficiency of GFP is also presented in this work. The formation efficiency of GFP is determined by changes to the fluorescence lifetime of a fluorophor attached to the GFP as a label.