Bestimmung des Interaktionsbereiches sowie der Struktur des Adrenodoxins im Komplex mit der Adrenodoxin-Reduktase mit Hilfe der paramagnetischen NMR-Spektroskopie

Abstract

In dieser Arbeit wurden der Interaktionsbereich und die Struktur des Adrenodoxins (Adx) im Komplex mit der Adrenodoxin-Reduktase (AdR) beschrieben. Beide Proteine sind wichtige Komponenten der Steroidhormon-Biosynthese. Für die Untersuchungen wurden AdR-Mutanten (AdR_A: AdR_C364S/S425C/K429C, AdR_B: AdR_C145S/C364S/Q232C/K236C) hergestellt, die jeweils ein exponiertes Cysteinpaar besitzen. Beide Mutanten zeigten gleiche strukturelle und funktionale Eigenschaften wie der AdR-Wildtyp (AdRWT). Der Interaktionsbereich des 15N2H-Adx im Komplex mit AdRWT wurde durch die Bestimmung der Chemischen-Verschiebungsänderung unter Anwendung der Transversalen Relaxationsoptimierten NMR-Spektroskopie (TROSY) bestimmt. CLaNP-5, eine Lanthanoid-ligierende Sonde, wurde über Disulfidbrücken an die AdR gekoppelt und für paramagnetische TROSY-NMR-Untersuchungen der Pseudokontaktverschiebungen und Paramagnetischen-Relaxationsverstärkungen eingesetzt. Die dadurch erhaltenen, weitreichenden Distanzinformationen wurden für Docking-Berechnungen des AdR-Adx-Komplexes verwendet. Diese Berechnungen wurden von Herrn Dr. Peter H.J. Keizers (Universität Leiden, Niederlande) durchgeführt. Der Interaktionsbereich des Adx in Wechselwirkung mit der AdR konnte damit in dieser Arbeit zum ersten Mal detailliert beschrieben werden, der seinerseits die eingehendere Bestimmung des AdR-Adx-Komplexes in Lösung ermöglichte.

In this work the structure of adrenodoxin (Adx) and its region, which is important for the interaction with adrenodoxin reductase (AdR), will be described. Both proteins are important components of the steroid hormone biosynthesis in the adrenal cortex. Therefore, two AdR mutants (AdR_A: AdR_C364S/S425C/K429C, AdR_B: AdR_C145S/C364S/Q232C/K236C) containing two exposed cysteins on the protein surface, respectively, have been prepared and characterized. AdR_A and AdR_B showed the same structural and functional properties as the wild type form of AdR. The exact interaction region of 15N2H-Adx in interaction with AdR wild type has been determined by measuring Chemical Shift Perturbations (CSP) using the method of Transverse Relaxation Optimized NMR-Spectroscopy (TROSY). Furthermore, to obtain long-range distance information by paramagnetic TROSY-NMR measurements, a Caged Lanthanide NMR Probe-5 (CLaNP-5) has been ligated to the AdR mutant surface via disulfide bridges, causing Pseudocontact Shifts (PCS) and Paramagnetic Relaxation Enhancement (PRE). These restraints (CSP, PCS, and PRE) have been used by Dr. Peter H.J. Keizers (University Leiden, The Netherlands) to perform docking experiments of Adx and AdR. This work describes in detail for the first time the interaction region of Adx and the structure of the AdR-Adx-complex in solution.