Monolithische Trennmedien für die Biochromatographie: Trenneffizienz, Peakkapazität und Retentionseigenschaften

Abstract

Trotz der jahrzehntelangen Anwendung der Chromatographie in der Routineanalytik, stellt die exakte Vorhersage der Retentionszeit immer noch ein großes Problem dar. Vor allem die enorme Komplexität der chromatographischen Vorgänge, die teilweise noch unverstanden sind, macht die exakte Retentionszeit-Vorhersage anhand der Analytstruktur extrem schwierig. Ziel dieser Arbeit war es ein Vorhersagemodell für die Ionenpaar-Umkehrphasen Chromatographie (IP-RPC) zu entwickeln. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde zunächst ein von M. Gilar entwickeltes Modell, bei dem die Retention durch Addition empirisch ermittelter Retentionsbeiträge der individuellen Aminosäuren bzw. Nukleotide ermittelt und anschließend durch Terme korrigiert wird, die die Gesamtstruktur des Moleküls berücksichtigen, erweitert und verbessert. Im Gegensatz zum Gilar'schen Ansatz, der sein Modell zur Vermeidung möglicher Sekundärstrukturen bei einer Trenntemperaturen von 60°C auf einer Silica-C18 Säule entwickelt und getestet hatte, wurde dieses Modell nun auf verschiedene stationäre Phasen (PS/DVB-Monolith, PS/DVB-C18 Säule und Silica-C18 Säule) und verschiedene Trenntemperaturen (30-80°C) erweitert. Diese Studie hat dabei gezeigt, dass dieses Vorhersage-modell bei hohen Trenntemperaturen, bei denen Sekundärstrukturen wie Haarnadeln oder partielle Doppelstränge weitestgehend unterdrückt werden, gute Ergebnisse liefert, während bei niedrigen Temperaturen der Einfluss von Sekundärstrukturen zu einer schlechten Übereinstimmung zwischen Vorhersage und Experiment führt. Unsere Versuche, ein verbessertes Retentionsmodell für Oligonukleotide IP-RPC auch bei niedrigen Trenntemperaturen zu entwickeln, beruhte auf der von Schölkopf et al. vorgeschlagenen -Supportvektorregression. Diese Methode bestimmt ein Modell für einen gegebenen Datensatz so, dass gleichzeitig der Modellfehler und die Modellkomplexität minimiert werden. Das Training dieses Modells erfolgt auf einer recht geringen Anzahl von 50-100 Oligonukleotiden. In der ersten Stufe unseres Verfahrens wurde ein Testdatensatz durch genaue Messung der Retentionszeiten von 72 Oligonukleotiden erstellt. Die Bestimmung der experimentellen Daten erfolgte dabei durch ein HPLC-System. Das Trainieren des SVR-Modells erfolgte anschließend durch Aufteilung des Testdatensatzes in drei Teile (je 24 Datenpunkte). Zwei Drittel der Testdaten wurden für das Trainieren des SVR-Modells verwendet, das restliche Drittel der Datenpunkte wurde zur Validierung der Vorhersage benutzt (dreifache Kreuzvalidierung). Die R2 und Q2 Werte geben dabei jeweils die Korrelation des SVR-Modells auf den Trainingsdatensatz bzw. die Korrelation der vorhergesagten Retentionszeiten mit den Experimentellen an. Die Ergebnisse haben dabei gezeigt, dass mittels dieses SVM-Modells die Retentionszeiten der Oligonukleotide unter allen experimentellen Bedingungen mit einer Genauigkeit von 0.7 — 1.2% vorhergesagt werden konnten. Im Gegensatz zum Additiven Vorhersagemodell konnten auch die Retentionszeiten der Haarnadelstrukturen unabhängig von den untersuchten Temperaturen, mit einer sehr hohen Genauigkeit vorhergesagt werden. Die gute Übereinstimmung zwischen experimentellen und berechneten Retentionszeiten ist dabei ein eindeutiges Indiz dafür, dass die im Modell integrierten Strukturparameter die Wechselwirkungen zwischen Oligonukleotid und stationärer Phase in der IP-RPC sehr gut beschreiben und das Modell damit zur Vorhersage auch komplexer Mischungen, unter allen experimentellen Bedingungen, geeignet ist. Die immer komplexer werdenden Probleme in der modernen Medizin, Pharmazie oder Biologie stellen immer höhere Anforderungen an die Analytik. Dabei hat sich gezeigt, dass das "bottle neck" immer noch in der Leistungsfähigkeit des Trennmediums, d.h. in der Effizienz der Trennsäule zu sehen ist. Daher ist die Neu- und Weiterentwicklung dieser Trennmedien entscheidend für die Lösung der Fragestellungen der heutigen Bioanalytik. In dieser Studie wurde ein 150 mm lange PS-DVB-Monolith (150 x 0.2 mm i.D.) systematisch auf das Auftreten von Inhomogenitäten sowie die Abhängigkeit der Trennleistung von der Säulenlänge untersucht. Dies wurde dadurch erreicht, dass ein 150 mm langer Monolith nacheinander in verschieden lange Teilstücke (150 mm, 75 mm und 37.5 mm) verkürzt und jede dieser Säulen mit den Probesubstanzen auf die chromatographischen Parameter Auflösung, Peakbreiten und Peakkapazität untersucht wurde. Als Probesubstanzen dienten dabei ein Peptid-Standard (P2693), eine Proteinmischung (9 Proteine) und ein Cytochrom C Verdau. In einem weiteren Teil dieser Arbeit sollte neben der Säulenlänge auch der Einfluss der Gradientlaufzeit auf die Peakkapazität untersucht werden. Dazu wurden mehrere längere ungekoppelte Monolithen (150-300 mm) mittels HPLC und HPLC-MS (ESI-Tof-Massenspektrometer) sowie Gradientenlaufzeiten zwischen 1-9h auf ihre Leistungsfähigkeit hin getestet. Die Verwendung eines Massenspektrometers als Detektor war notwendig, da aufgrund der Komplexität des als Probe verwendeten BSA-Thyroglobulin-Verdaus die Bestimmung der relevanten chromatographischen Parameter (Peakbreiten) aus den reinen UV-Daten, wegen zahlreicher Koelutionen der Analyten, nur schwierig möglich war. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Säulenlänge und der Gradientdauer zu einer signifikanten Verbesserung der Peakkapazitäten führten. So konnten mit den neuen, längeren Trennsäulen, unter Verwendung langer Gradienten (9h), Peakkapazitäten bis annährend 1000 generiert werden.

Because of the increasing need for linkers, primers and probes, single-stranded oligonucleotides have become very important in biochemistry, molecular biology, and medicine. Ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography (IP-RP-HPLC) has become one of the most important and efficient methods for the separation of oligonucleotides. In spite of the broad application of IP-RP-HPLC, no reliable models are available so far for the prediction of oligonucleotides retention as a function of their sequence. In the first part of our study we used an existing mathematical prediction model which was developed by M. Gilar and tried to improve the quality of that model. The retention prediction of this model is based on empirical coefficients which are specific for each nucleotide, each stationary phase and each separation temperature. Therefore the first challenge was to determine these coefficients for all temperatures and all separation conditions (stationary phases). The biggest disadvantage of the mathematical model is the fact that it does no consider secondary structural parameters of the analytes for the prediction of the retention times and therefore the prediction results via this model lead to a bad correlation between the experimental and predicted retention times. Especially the prediction of retention times of hairpin structures at low temperatures yielded unacceptable results. For setting up a new model for chromatographic retention, the elution times of 72 oligonucleotides with different lengths and sequences were measured on a 60 x 0.2 mm i.d. monolithic poly-(styrene/divinylbenzene) column and a 50 x 4.6 mm i.d. column packed with 2 µm poly-(styrene/divinylbenzene-C18) particles using different separation temperatures. To determine the influence of the sequence on retention 41 of the oligonucleotide sequences were generated by variation of a 24-mer. To take into account other possible secondary structures, four further sequences were selected that form stable hairpin structures even at higher temperatures. The remaining sequences were finally selected so that they covered a length range of 15-48 nucleotides. A mathematical model was built using the retention data in connection with the principle of statistical learning theory (support vector regression-SVR). The training properties incorporated into the model included oligonucleotide length and base composition, base stacking energies, as well as secondary structures due to hairpin formation. To train our model the dataset of the 72 oligonucleotides was divided into three parts (each of 24 data points) and two thirds of the data were used to train the SVR model whereas the remaining third was used for validation of the prediction (Triple cross-validation). In each case, the values of R2 and Q2 represent the correlation of the SVR model with the training dataset and the correlation of the predicted retention times with the experimental times, respectively. The model yielded excellent fits in a temperature range of 30-80 °C and allowed the prediction of retention time of any 13-50-mer oligonucleotide not used in the training of the model with an accuracy of better than 2%. Finally, the method was utilized for the prediction of mixtures of primers utilized in multiplex polymerase chain reactions. As already seen for the 72 oligonucleotides, the model was able to predict the retention times of the primer mixture correctly, except the inversion of two primers, at all separation temperatures (40°C, 50°C and 70°C). The retention times were predicted with an average and maximum deviation of 1.6 — 3.2%. The good agreement between the experimental and predicted retention times indicates that the structural parameters integrated into the model describe the interaction between the analytes and the stationary phase in IP-RPC very well. During the past years, several groups have successfully put into practice the concept of using very long columns packed with small particles in order to increase column efficiency and peak capacity. Nevertheless, while the increase in plate number with long columns run under isocratic conditions has been clearly proven, the attainable increase in peak capacity with longer columns in gradient separations remains under dispute, especially in the separation of biopolymers such as peptides or proteins. In order to gain an insight into the effect of column length on the separation power of monolithic columns, we designed a study dealing with the chromatographic performance of monoliths in peptide and protein separations. Based on the theory of Snyder an increase in column length by e.g. a factor of 2 should effect an increase in peak width by a factor of √2. If this model holds, then the column length should not have a large impact on total peak capacity in gradient elution, as long as the column is not overloaded. Using long monolithic columns and a separation time of 60 minutes, average peak widths of 9-10 s and peak capacities of approx. 400 were obtainable. Upon increasing the gradient time to 540 min, peak capacities of more than 900 were obtained with 210 mm long columns. The study revealed that high peak capacities were achievable by applying long monolithic columns and long separation times. In contrast to column length and gradient time, the flow rate showed no significant influence on peak width and peak capacity. The study also revealed that uncoupled columns had much better separation efficiencies than coupled columns. Moderate pressure drops were sufficient to run the columns, making long poly-(styrene/divinylbenzene) monoliths suitable for the separation of complex mixtures of peptides or proteins.