Role of SNARE regulators : Complexin and Synaptotagmin in Ca2+ -triggered exocytosis

Abstract

Regulated neurotransmitter release is orchestrated by fusogenic SNARE proteins, the regulatory proteins, Complexin and Synaptotagmin. Complexin is believed to hinder premature exocytosis by clamping the membrane-bridging, partially assembled SNARE complex at a partially zippered state whereas Synaptotagmin1 acts as major Ca2+ sensor, synchronizing the fusion event to Ca2+ stimulus. Despite intensive research, the exact molecular mechanisms of how these SNARE ‘regulators’ and their potential interplay govern neurotransmitter release have remained enigmatic and are therefore the theme of this dissertation. Previous studies have demonstrated that Cpx C-terminus clamps premature vesicle secretion and the N-terminus of Cpx accelerates the kinetics of exocytosis. Based on these findings, we set out to pinpoint crucial amino acid residues within the Cpx C-terminus and how they may mediate the molecular ‘clamp’ action of the protein preventing tonic secretion. In the framework of structure-function analysis, the results illustrate that the last 34 amino acids of Cpx are most responsible for preventing premature vesicular fusion. In particular, a C-terminal stretch of 19 amino acids, forming an amphipathic helix, turned out to be crucial for the clamp action. Mutating specific hydrophobic residues (Cpx2L124,128W mutant) in the C-terminus strongly impaired the clamp action. Based on these results and other corroborating evidences, we propose a model wherein the C-terminal amphipathic region acts as an alternative SNARE motif and thereby hinders progressive zippering of SNARE proteins. In a separate set of experiments, we investigated the functional relationship between Cpx2 and the secondary Ca2+ sensor, Syt7 which is expressed in mouse chromaffin cells. The results show that Syt7 functions as a Ca2+ sensor for vesicle secretion, particularly at low Ca2+ concentrations. In the absence of Syt7, Cpx2 clamps premature secretion like in wt cells confirming that Cpx directly clamps SNARE proteins and not the Ca2+ sensor. Furthermore, in the absence of Cpx2, additional loss of Syt7 strongly aggravates the Cpx2 ko phenotype in contrast to Cpx2-Syt1 dko cells. This result shows that Cpx2 and Syt7 operate in different molecular steps en route to vesicle fusion. The combined set of data supports a scenario wherein Syt7 mediates early stages of vesicle priming and as the vesicles attain full release competence, they require Syt1 mediation for rapid release. Taken together, this doctoral thesis pinpoints key properties of SNARE regulators shedding light on crucial regions of Cpx and the functional relevance of Syt7 in Ca2+ triggered exocytosis.

Die regulierte Neurotransmitterfreisetzung wird durch fusogene SNARE-Proteine, die regulatorischen Proteine Complexin und Synaptotagmin gesteuert. Es wird angenommen, dass Complexin eine vorzeitige Exozytose verhindert, indem der membranüberbrückende, teilweise zusammengesetzte SNARE-Komplex in einem Zustand mit teilweisem Reißverschluss geklemmt wird, während Synaptotagmin1 als Haupt-Ca2+ -Sensor fungiert und das Fusionsereignis mit dem Ca2+ -Stimulus synchronisiert. Trotz intensiver Forschung sind die genauen molekularen Mechanismen, wie diese SNARE-Regulatoren und ihr mögliches Zusammenspiel die Freisetzung von Neurotransmittern steuern, rätselhaft geblieben und daher das Thema dieser Dissertation. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Cpx-C-Terminus die vorzeitige Vesikelsekretion hemmt und der N-Terminus von Cpx die Kinetik der Exozytose beschleunigt. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben wir uns vorgenommen, wichtige Aminosäurereste im Cpx-CTerminus zu lokalisieren und herauszufinden, wie sie die molekulare "Clamp" -Wirkung des Proteins, das die tonische Sekretion verhindert, vermitteln können. Im Rahmen der Struktur- Funktions-Analyse zeigen die Ergibnisse, dass die letzten 34 Aminosäuren von Cpx am stärksten für die Verhinderung einer vorzeitigen vesikulären Fusion verantwortlich sind. Insbesondere ein C-terminaler Abschnitt von 19 Aminosäuren, der eine amphipathische Helix bildet, erwies sich als entscheidend für die Klemmwirkung. Das Mutieren von spezifischen hydrophoben Resten (Cpx2L124,128W-Mutante) im C-Terminus beeinträchtigt die Klemmwirkung stark. Basierend auf diesen Ergebnissen und anderen Beweisen schlagen wir ein Modell vor, bei dem die C-terminale amphipathische Region als alternatives SNARE-Motiv fungiert und dadurch das progressive Zippen von SNARE-Proteinen behindert. In einer separaten Reihe von Experimenten untersuchten wir die funktionelle Beziehung zwischen Cpx2 und dem sekundären Ca2+ -Sensor Syt7, der in Chromaffinzellen der Maus exprimiert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass Syt7 als Ca2+ -Sensor für die Vesikelsekretion fungiert, insbesondere bei niedrigen Ca2+ -Konzentrationen. In Abwesenheit von Syt7 klemmt Cpx2 die vorzeitige Sekretion wie in WT-Zellen und bestätigt, dass Cpx SNARE-Proteine direkt klemmt und nicht den Ca2+ -Sensor. Darüber hinaus verstärkt ein zusätzlicher Verlust von Syt7 in Abwesenheit von Cpx2 den Cpx2-ko-Phänotyp im Gegensatz zu Cpx2-Syt1-dko-Zellen. Dieses Ergebnis zeigt, dass Cpx2 und Syt7 auf dem Weg zur Vesikelfusion in verschiedenen molekularen Schritten arbeiten. Der kombinierte Datensatz unterstützt ein Szenario, bei dem Syt7 frühe Stadien der Vesikelvorbereitung vermittelt und bei Erreichen der vollständigen Freisetzungskompetenz eine Syt1-Vermittlung für eine schnelle Freisetzung erforderlich ist. Zusammenfassend zeigt diese Doktorarbeit wichtige Eigenschaften von SNARE-Regulatoren auf, die ein neus licht auf die wichtigen Bereiche von Cpx und die funktionelle Relevanz von Syt7 in Ca2+ -ausgelösten Exozytose